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1、免疫親和純化和免疫沉淀技術(shù)瀘州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室劉佳佳20010年4月親和層析及沉淀的用途親和層析及沉淀被認(rèn)為是分離純化酶及蛋白質(zhì)的強(qiáng)有力的技術(shù)手段，這種方法可以較經(jīng)濟(jì)有效地使用配基，能夠大規(guī)模、快速、特異性地分離、純化酶及蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、防御、調(diào)控及記憶、識(shí)別等多種生理功能。蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)分離純化是用生物工程下游技術(shù)從混合物之中分離純化出所需要得到的目的蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)是當(dāng)
2、代生物產(chǎn)業(yè)和生命科學(xué)研究當(dāng)中的核心技術(shù)。該技術(shù)難度和成本均高；例如一個(gè)生物藥品的成本75%都花在下游蛋白質(zhì)分離純化當(dāng)中。生物工程上游技術(shù):是理論的研究,技術(shù)的開(kāi)發(fā)等,如：基因工程、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究等。生物工程下游技術(shù)：一般包括產(chǎn)物（一般為蛋白質(zhì)）的預(yù)處理及分離純化；產(chǎn)品的成型加工和質(zhì)量監(jiān)控等一系列單元操作和過(guò)程中的主要技術(shù),其中生化產(chǎn)物及發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化是其核心內(nèi)容。下游技術(shù)是生物工程重要組成部分,是生物高科技技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，如：酶工程,發(fā)酵工程等（提取干擾素、胰島素和酶等）。蛋白質(zhì)分離純化的意義①?gòu)?/p>
3、生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需 要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要：DNA合成酶、RNA逆轉(zhuǎn)錄酶等。蛋白純化策略分離蛋白質(zhì)常用的純化方法有超速離心和梯度密度離心法、鹽析法、電泳、凝膠過(guò)濾（分子篩）、離子交換層析、親和層析以及高效液相色譜等方法……。親和沉析技術(shù)是純化各種生物大分子最有效的方法之一。超速離心是分
4、離亞細(xì)胞及蛋白質(zhì)大分子的有效手段，往往是進(jìn)一步純化的第一次過(guò)篩。超速離心又分差速離心和梯度離心。用超速離心或梯度離心分離和純化抗原只是一種根據(jù)蛋白的比重特點(diǎn)分離的方法，除個(gè)別成分外，極難將某一抗原成分分離出來(lái)。目前僅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原蛋白如載脂蛋白A、B等。對(duì)于大量的中、小分子量蛋白質(zhì)，多不適宜用超速及梯度密度離心作為純化手段。鹽析沉淀法是最古老而又經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化分離技術(shù)。由于方法簡(jiǎn)便、有效、不損害蛋白抗原活性等優(yōu)點(diǎn)，至今仍被廣泛應(yīng)用。鹽析法原理鹽析沉
5、淀法的原理因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是親水性大分子，所以在水溶液中有雙電層結(jié)構(gòu)的水合膜，來(lái)保證分子的溶解度平衡并穩(wěn)定存在。當(dāng)加入鹽時(shí)，鹽會(huì)電離成離子態(tài)，離子的電性破壞了蛋白質(zhì)的雙電層的水合膜結(jié)構(gòu)，從而使其沉降，析出。加入濃酸和濃堿是不行的，苛性的環(huán)境將使蛋白質(zhì)變性。凝膠過(guò)濾和離子交換層析凝膠過(guò)濾又稱凝膠柱層析、分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分分離。離子交換層析是利用一些帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附帶相反電荷的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。這兩種層析如能共同應(yīng)用或者反復(fù)應(yīng)用其中的一種，皆可將某
6、一蛋白質(zhì)從一復(fù)雜的組分中純化出來(lái)。凝膠過(guò)濾(分子篩層析)圖示1凝膠過(guò)濾(分子篩層析)圖示2離子交換層析柱親和層析是利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。例如抗原和抗體（免疫親和層析）、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結(jié)合成復(fù)合物。如果將復(fù)合物的一方固定在不溶性載體或共價(jià)結(jié)合在一種惰性的微珠上，則可從溶液中專一地分離和提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能產(chǎn)生相當(dāng)高的純化作用。另外，此法的優(yōu)點(diǎn)是迅速
7、，有時(shí)僅一步即可達(dá)到純化的目的。免疫親和純化技術(shù)親和純化(affinitypurification)是基于目標(biāo)分子與固定化配體的特異性相互作用(如：抗原-抗體)。親和技術(shù)可用來(lái)從混和物中分離特定分子。捕獲目標(biāo)分子用于相互作用研究,或從反應(yīng)體系中去除某一成分。免疫親和純化原理免疫親和純化是一種分離各種生物大分子最有效的方法特點(diǎn)：1、高純化率，通常為常規(guī)純化的1,000-10,000倍以上。2、由于內(nèi)在的背景限制，如目標(biāo)抗原量非常稀少，需與其他方法結(jié)合才能獲得均質(zhì)性產(chǎn)物。3、快速純化抗原，層析柱?？芍貜?fù)使用?？砂凑詹?/p>
8、同規(guī)模進(jìn)行，半天內(nèi)即可完成。4、不僅適用于純化抗原，也可用來(lái)分離經(jīng)過(guò)初步純化的抗體，乃至所有能與相應(yīng)配體有效結(jié)合的生物分子。5、抗體與其相應(yīng)抗原結(jié)合具有高度親和力和特異性，能大量分離天然狀態(tài)或近似天然狀態(tài)的抗原。6、需要適當(dāng)純化的抗體，不是所有的抗體都適用于免疫親和層析，但一旦獲得一種性能良好的抗體，純化過(guò)程就簡(jiǎn)單、快速、可靠。7、不能用于定量測(cè)定。免疫親和純化技術(shù)發(fā)展歷
