川芎嗪對(duì)青霉素致癇大鼠神經(jīng)元內(nèi)caspase3表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率

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1、川芎嗪對(duì)青霉素致癇大鼠神經(jīng)元內(nèi)Caspase3表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率【摘要】　　目的:探討川芎嗪(TMP)對(duì)青霉素致癇大鼠大腦神經(jīng)元內(nèi)Caspase3表達(dá)的平均光密度及陽(yáng)性面積率的變化。方法:使用青霉素致癇大鼠模型,采用BL410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄雙側(cè)大腦皮層癇樣放電,待癲癇樣放電穩(wěn)定后,腹腔注射不同劑量的TMP,待其抑制作用最明顯時(shí),取大腦切片,觀察大腦神經(jīng)元內(nèi)Fas表達(dá)的變化。結(jié)果:TMP對(duì)青霉素致癇大鼠大腦神經(jīng)元內(nèi)Caspase3表達(dá)的平均光密度及陽(yáng)性面積率顯著降低。結(jié)論:TMP對(duì)青霉素致癇大鼠大腦

2、神經(jīng)元有明顯的保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】川芎嗪；癲癇放電；神經(jīng)元；青霉素；Caspase　　川芎嗪,化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TMP)。TMP可抑制海馬神經(jīng)元的放電活動(dòng),TMP可明顯抑制嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀及體重下降［1］,大劑量TMP對(duì)缺血、缺氧性腦損傷、海馬CA1神經(jīng)元的缺血性損傷有改善或保護(hù)作用［2,3］。TMP已被廣泛應(yīng)用于心、腦血管閉塞性疾病的治療［4］。Caspase3是在調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程中的比較重要的蛋白質(zhì)，Caspase3是Caspase家族中比較重要的一員。Caspas

3、e是cystEinecontainingaspartatespecificprotease的縮寫，即含半胱氨酸的天冬氨酸特異水解酶。Caspase家族是一組蛋白水解酶，其特點(diǎn)是：①它們都有發(fā)揮酶活性所必須的半胱氨酸；②都能特異地裂解天冬氨酸位點(diǎn)；③前體蛋白均無(wú)活性，均需經(jīng)蛋白水解后才產(chǎn)生活性；④轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞可誘導(dǎo)凋亡。根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的順序給予編號(hào)，迄今為止共發(fā)現(xiàn)了14個(gè)成員。根據(jù)Caspase的一級(jí)結(jié)構(gòu)和介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的N末端的原結(jié)構(gòu)域，可將其分為2類：①啟動(dòng)子Caspase，如Caspase8、Caspas

4、e9和Caspase10，它們通過(guò)自身催化而激活；②效應(yīng)子Caspase，如Caspase3、Caspase6和Caspase7，它們能分解細(xì)胞蛋白，起凋亡執(zhí)行器的作用。目前認(rèn)為Caspase是一切凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路，各種Caspase如同凝血因子一樣“瀑布式”(cascade)層層激活，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡［5～7］?！　”菊n題采用免疫組織化學(xué)方法、圖像分析技術(shù)檢測(cè)了TMP對(duì)青霉素致癇大鼠大腦神經(jīng)元內(nèi)Caspase3表達(dá)的平均光密度及陽(yáng)性面積率的變化影響,并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制?！　?材料與方法　　1.1材

5、料　　1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠(由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),雌雄不拘,體重200～250g?！　?.1.2實(shí)驗(yàn)藥品及試劑鹽酸川芎嗪注射液(批號(hào)0107001),常州制藥廠生產(chǎn)；注射用青霉素鈉(批號(hào)00109306),華北制藥股份有限公司生產(chǎn)。　　1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器BL410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),成都泰盟電子有限公司生產(chǎn)；江灣IC型立體定向器,第二軍醫(yī)大學(xué)器材處生產(chǎn)?！　?.2方法　　1.2.1癲癇動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)選用健康SD大鼠,用10%烏拉坦以10ml·kg-1體重腹腔注射(ip)麻醉,將動(dòng)物固定在江灣I2C型

6、立體定向器上,于大腦左、右兩側(cè)前鹵后3mm,矢狀縫旁開(kāi)3mm行開(kāi)顱手術(shù),暴露大腦皮層記錄區(qū)域(2mm×2mm),將銀球電極置于左、右兩側(cè)的記錄部位,信號(hào)輸入置BL410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),進(jìn)行左、右兩側(cè)腦電記錄。用浸有青霉素溶液的明膠海綿(200u/mm3)置于左側(cè)大腦皮層表面,誘發(fā)大鼠大腦皮層癲癇樣放電,待癲癇放電穩(wěn)定后,移去明膠海綿,用浸有溫?zé)嵘睇}水棉球蓋住創(chuàng)口。　　1.2.2試驗(yàn)分組及取材將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組,每組8只:①A組(手術(shù)對(duì)照組),麻醉開(kāi)顱手術(shù)1h后取大腦;②B組(青霉素致癇組),青霉素誘發(fā)癲癇1h后

7、取大腦；③C組(TMP10mg·kg-1治療組),青霉素誘發(fā)癲癇放電穩(wěn)定后,再腹腔注射TMP(10mg·kg-1),待抑制作用最明顯時(shí)取大腦；④D組(TMP20mg·kg-1治療組),青霉素誘發(fā)癲癇放電穩(wěn)定后,再腹腔注射TMP(20mg·kg-1),待抑制作用最明顯時(shí)取大腦；⑤E組(TMP40mg·kg-1治療組),青霉素誘發(fā)癲癇放電穩(wěn)定后,再腹腔注射TMP(40mg·kg-1),待抑制作用最明顯時(shí)取大腦。　　1.2.3HE染色常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚約4μm)及HE染色?！　?.2.4免疫組織化學(xué)SP法檢

8、測(cè)Bcl2相關(guān)抗原　　主要步驟：　?、俳M織切片5μm，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗；　　②3%過(guò)氧化氫，37℃孵育10min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS洗4×5min；　?、跙cl2采用微波抗原修復(fù)（3檔，10min），PBS洗4×5min；　?、苷Ｑ蜓?7℃孵育10min以減少非特異性反應(yīng)；　?、菀豢梗˙c