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1、鎳離子金屬親和層析柱在蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用摘要：蛋白質(zhì)純化是進行基因工程中最重耍的環(huán)節(jié)，選取純化蛋白的工具對純化結(jié)果影響巨大。鎳離子親和層析柱具有特異性高、純度高、成本低、產(chǎn)量大等優(yōu)點，鎳離子親和層析柱的國產(chǎn)化將極人促進蛋白質(zhì)純化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展并會產(chǎn)生巨大的市場效益。關(guān)鍵詞：鎳離子親和層析柱、蛋白質(zhì)純化、國產(chǎn)化親和層析(Affinitychromatography，AC)是利用生物大分子和固定相表面的親和配基之間可逆的特異性相互作川，進行選擇性分離的一種液相層析分離方法。常用的親和層析方式為金屬螯合親和層析，乂
2、稱固定化金屬離子親和層析(Immobilizedmetallchelatedaffinitychromatography,IMAC)，利川金屬離子(Ni2+,Cu2+等)與氨基酸表面的殘基(如組氨酸的咪唑基)的配位鰲合作用，來純化與金屬離子有親和作用的蛋白質(zhì)。由于IMAC具有螯合介質(zhì)制備簡單方便，吸附容量大，選擇性及通用性較好，易于再生，成本低等優(yōu)點，逐漸成為分離純化蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品最有效的技術(shù)之一。鎳離子親和層析柱成為金屬螯合親和層析的代表產(chǎn)品。目前，M外有3-4家鎳離子親和層析柱產(chǎn)品在國內(nèi)銷儔，但
3、價格昂貴，國內(nèi)己有數(shù)家公司開展了鎳離子親和層析柱產(chǎn)品的銷售，其中，廣州精達公司采用最新的鎳離子親和層析柱的制備技術(shù)，順利完成了該種產(chǎn)品的國產(chǎn)化。I、鎳離子親和層析柱的制備工藝1、Ni2+吸附融合蛋白原理Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有His(組蛋白)標簽的堿性蛋白結(jié)合，組蛋白標簽一般是6個組氨酸(堿性氨基酸)。同時Ni柱屮的氯化鎳或者硫酸鎳也可以與咪唑結(jié)合，利用咪唑梯度洗脫，從而獲得純度較高的融合蛋白。而利川基因工程技術(shù)制備的融合蛋白常攜帶6個組氨酸的標簽，因6個組氨酸標簽因肽片段小，故對目標蛋白質(zhì)的生
4、物活性影響較小，因此被廣泛用于重組蛋白的制備及純化。2、固相載體的選擇常見的固相載體包括為普通瓊脂糖顆粒及GE公司生產(chǎn)的Sepharose瓊脂糖系列產(chǎn)品。普通的瓊脂糖顆粒具有造價低，但結(jié)合蛋白不穩(wěn)定，易造成鎳離子脫落的重大缺點。而GE公司生產(chǎn)的Sepharose瓊脂糖系列產(chǎn)品采用交聯(lián)瓊脂糖，具有高吸附力、高化學物理穩(wěn)定性、快流速、強抗壓力等特點,因此I?分適合作為親和層析柱屮的固相載體。該系列包含有兒類產(chǎn)品包招：Sepharose4B、Sepharose6B、Sepharose4FF>Sepharose6
5、FF等。實驗發(fā)現(xiàn)Sepharose4B的空間位阻效應(yīng)較小，可結(jié)合較大量的蛋白質(zhì)，而且還克服了Sepharose6B流速慢的缺點，在蛋白質(zhì)純化屮能夠得到相同的結(jié)果，因此，采用Sepharose4B成為當前較好的選擇。3、配基的選擇常見的配基包括次氮基三乙酸(Nitrilotriaceticacid,NTA)及亞氨基二乙酸(IminodiaceticAcid,IDA)。NTA中的一個氮原子、三個氧原子與金屬離子結(jié)合后，金屬離子空余兩個空軌道與蛋白質(zhì)結(jié)合。而IDA則是一個氮原子、兩個氧原子與金屬離子結(jié)合，金屬離
6、子空余三個空軌道與蛋白質(zhì)結(jié)合。因此，IDA具有更高的蛋白質(zhì)結(jié)合能力，利用IDA具備的鎳離子金屬親和層析柱具有更高吸附蛋白質(zhì)的能力，因而被廣泛運用。II、廣州精達公司鎳離子親和層析柱鎳離子親和層析柱在純化蛋白中用量大，運用范圍廣，相較于價格較高的國外產(chǎn)品，生產(chǎn)價格便宜且性能更為良好的國內(nèi)產(chǎn)品成為當前迫切需要解決的問題。廣州精達醫(yī)學科技有限公司是由美國免疫學附士胡勇創(chuàng)立的生物醫(yī)藥公司。公司制備鎳離子親和層析柱選購國外原材料，同時釆用全套的美國生產(chǎn)工藝(圖1),同吋采用先進的偶聯(lián)技術(shù)，降低生產(chǎn)成本，具備大規(guī)模產(chǎn)
7、業(yè)化資質(zhì)。分離純化系統(tǒng)高速冷凍離心機全自動發(fā)酵設(shè)備圖1采用先進的化學偶聯(lián)技術(shù)，將鎳離子與瓊脂糖Sepharose4B進行結(jié)合，同時連接IDA配基結(jié)合鎳離子，制備成鎳離子親和層析柱(Ni2+-IDA)。用戶在使用層析柱時，粗蛋白樣品中0的融合蛋白與鎳離子特異性結(jié)合，其他雜蛋白因為不能與鎳離子結(jié)合而穿過層析柱。結(jié)合在柱子上的融合蛋白可以用梯度咪唑進行洗脫使之解離，用收集管編號收集以達到純化蛋白質(zhì)的目的。一般管中收集的融合蛋白用蛋白膠(SDS-PAGE)進行檢測，并判斷蛋白的純度及濃度。閣2顯示的為廣州精達公司
8、鋃離子親和層析柱純化融合蛋白的效果圖(SDS-PAGE電泳膠)。根據(jù)圖中顯示，經(jīng)精達公司層析柱洗脫后，純化的融合蛋白純度高、雜蛋白含量低，純化效果良好。M1234圖2蛋白質(zhì)純化12°/。SDS-PAGE電泳圖M=Marker1=上樣液2-3,流穿液4,洗脫液廣州精達公司鎳離子親和層析凝膠及親和層析柱產(chǎn)品可參見圖3。圖3精達公司鎳離子親和層析住融合蛋白的純化對基因工程后續(xù)實驗具有十分重要的意義，包括獲得單一活性蛋白質(zhì)用于產(chǎn)品生產(chǎn)
