用gateway技術(shù)克隆并表達(dá)漢灘病毒g1蛋白itam樣基序論文

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1、用Gateway技術(shù)克隆并表達(dá)漢灘病毒G1蛋白ITAM樣基序論文牟丹蕾，姜泓，王英鵬，李光玉，潘蕾，李新紅，王臨旭，張巖.freelutatedG1ITAMlikesequenceconstructsofHantaanvirus.METHODS:G1ITAMlikesequenceencodinggenesofHantaanvirusplifiedfromcDNAofthevirusstrain84FLiusingRTPCR.MutagenesisoftheITAMlikesequenceedpENTRTM/DTOPO.Therebinationreactionedu

2、singGateemixtotransferthedesiredgenesintotheGateedbyL(aa569aa642),pDESTITAM(aa602aa634)andpDESTITAMYYFF(Y615F,Y628F),easuredbySDSPAGE.likesequencesmunoreceptortyrosinebasedactivationmotifs0引言腎綜合征出血熱(HFRS)在我國廣為流行，嚴(yán)重危害人民的生命健康［1］.漢灘病毒（HTNV）引起的HFRS重危癥多，病死率高，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明.Geimonen等［2］的研究表明免疫受體

3、酪氨酸酶活化基序（ITAM）—免疫受體活化性信號(hào)傳遞有關(guān)的一段以兩個(gè)酪氨酸殘基為中心的序列［3］存在于HPS相關(guān)病毒囊膜糖蛋白1（glycoprotein1,G1）胞質(zhì)區(qū)尾段，具有免疫受體ITAM相似的功能.HFRS相關(guān)HV（HTNV，SEOV，DOBV）的G1胞質(zhì)區(qū)存在ITAM樣基序（ITAMlikesequences），基本形式為YxxLx9YxxT.HTNV與HPS相關(guān)病毒同屬于漢坦病毒（hantavirus,HV）屬，基因結(jié)構(gòu)有較高的同源性.我們以此為切入點(diǎn)，克隆并表達(dá)HTNVG1蛋白ITAM樣基序及其突變體，獲得G1ITAM樣基序及其突變基序的融合蛋白，為進(jìn)一步探討HTN

4、VG1蛋白ITAM樣基序在HFRS免疫信號(hào)傳遞中的作用奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料HTNV84FLi株由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所出血熱及蟲媒病毒研究室保存.Gateega公司)；PyrobestTMDNA多聚酶和DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000，DL15000(日本TaKaRa公司)；SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶和GateAb(美國Chemicon公司)；細(xì)菌GST融合蛋白柱純化試劑盒(美國PIERCE公司)；總RNA提取試劑盒TRIZOLLS(美國Gibco公司)；生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，鏈酶親合素—過氧化物酶復(fù)合物，二氨基聯(lián)苯胺（DAB），葡萄糖氧化酶及小量

5、質(zhì)粒抽提純化試劑盒(美國Sigma公司)；預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)(美國紐英倫生物技術(shù)有限公司).1.2方法1.2.1病毒RNA提取以0.01～0.1感染復(fù)數(shù)(MOI)的HTNV疫苗生產(chǎn)株84FLi感染VeroE6細(xì)胞，待間接免疫熒光法檢測細(xì)胞質(zhì)中特異性熒光達(dá)到～時(shí)收獲病毒，參照Trizol試劑盒操作說明提取病毒感染細(xì)胞總RNA.1.2.2引物設(shè)計(jì)與基因合成參照HTNV國際標(biāo)準(zhǔn)毒株76~118株［3］，中國代表株A9株（GenBank注冊(cè)號(hào)：AF345636）及84FLi株（GenBank注冊(cè)號(hào)：AF035831）核苷酸序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增HTNVG1胞質(zhì)區(qū)尾段aa569aa642和aa6

6、02aa634編碼序列（含ITAM樣基序的編碼基因）的PCR引物FP1，RP1和FP2，RP2，由TaKaRa公司合成；同時(shí)合成一段突變G1ITAM樣基序中兩個(gè)保守的酪氨酸殘基(Y615F，Y628F)的G1胞質(zhì)區(qū)尾段aa602aa634的編碼基因，連接入pMD18中構(gòu)建成克隆載體pMDITAMYYFF.1.2.3RTPCR以提取病毒感染細(xì)胞的總RNA為模板，以14bp隨機(jī)引物和RP1為反轉(zhuǎn)錄引物，采用SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶按常規(guī)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；以合成的cDNA及pMDITAMYYFF為模板，分別以FP1,RP1和FP2,RP2為引物應(yīng)用Pyrob

7、estTMDNA多聚酶進(jìn)行擴(kuò)增，退火溫度分別為55℃和60℃.1.2.4應(yīng)用Gateg/L，四環(huán)素20mg/L）培養(yǎng)基中培養(yǎng)至A600nm=~0.8，按1:20轉(zhuǎn)種于新鮮的LB（含羧芐青霉素60mg/L）培養(yǎng)基中，37℃快速震蕩培養(yǎng)至A600nm=~0.4，加L阿拉伯糖至終濃度為5mmol/L,加葡萄糖至終濃度為56mmol/L，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)5h至A600nm=2~3，于誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后1,3,5h時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)菌樣本1次，向細(xì)菌沉淀中加入裂解緩沖液，室