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《hcv核心蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達及自激活作用檢測論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、HCV核心蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達及自激活作用檢測論文劉敏，張偉,陳天艷,藺淑梅,劉錦鋒,葉峰，趙英仁，張樹林【關鍵詞】蛋白RoleofHCVcoreproteininyeasttinreportergeneexpressionandactivation【Abstract】AIM:ToconstructthebaitvectorofHCVcoreproteininyeasttandthentostudyitseffectonthegroentsencodingHCVcoreregionplifiedbyPCRandsubsequentlyclonedintopUC19.
2、Afterverifiedbysequencing,they.TheserebinantplasmidsentsofHCVcoreprotein3canbeutilizedtofishHCVcoreregioninteractingprotein.HCVcoreproteindoesnothaveselfactivatingfunction.【Key;reportergene【摘要】目的：檢測用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段構建的酵母雙雜交誘餌載體的表達產(chǎn)物對酵母細胞有無毒性作用及對報告基因有無激活作用.方法：PCR擴增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段
3、，分別克隆入pUC19質(zhì)粒，經(jīng)測序正確后，再分別亞克隆入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中.將重組質(zhì)粒導入酵母菌AH109，檢測其表達產(chǎn)物在酵母細胞中對報告基因有無激活作用.結果：成功獲得含HCV核心蛋白的cDNA片段.freelL微量離心管中，加入已構建好的誘餌載體0.1μg，鯡魚精DNA0.1mg和0.1mL酵母感受態(tài)細胞.混勻后加入0.6mLPEG/LiAc溶液.在30℃以200r/min振蕩培養(yǎng)30min,加入70mLDMSO后混勻,在42℃水浴15min,冰浴2min,5000r/min離心5s,去上清，以0.5mL1×TE重懸細胞后，鋪于SD/Trp平板.于30℃
4、培養(yǎng)36h左右，直至帶有誘餌載體的酵母克隆長出.1.2.5蛋白表達的檢測1.2.5.1酵母全菌蛋白的抽提挑取幾個已轉化的酵母菌在5mLSD/Trp培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)過夜,次日轉接于50mLSD/Trp培養(yǎng)液,在30℃以230r/min振蕩培養(yǎng)至A600nm=0.4～0.6.在4℃，1000r/min離心收菌.將菌體置于液氮中凍存.以60℃的裂解緩沖液200μL融解菌體,混勻后加入0.2g玻璃珠,70℃孵育10min,劇烈混旋1min,在4℃，5000r/min離心5min.上清轉移至新的Eppendorf管備用.沉淀在100℃水浴5min，再劇烈混旋1min，在4℃，5000r
5、/min離心5min后，上清轉移至上述的Eppendorf管內(nèi),100g/LSDSPAGE電泳分析.1.2.5.2r為19×103可見明顯目的條帶且無雜帶（圖4）.2.5HIS3報告基因表達的檢測可見單純AH109酵母菌只在SD/Ura平板上生長，而含有pGBKT7核心蛋白質(zhì)粒的AH109酵母菌可以在SD/Ura和SD/Trp平板上生長，但所有克隆在SD/His和SD/Leu平板上均不生長.2.6LacZ報告基因表達的檢測含有HCV核心蛋白的酵母細胞顯色中可見LacZ報告基因沒有被HCV核心蛋白激活(圖5).當LacZ報告基因被激活時β半乳糖苷酶大量表達，活性增高，在Xag
6、al存在時，菌落顯深藍色，且擴散面積較大.3討論酵母雙雜交技術是目前應用較多的釣取與已知蛋白直接相互作用分子的方法［5］.我們在酵母雙雜交Gal4系統(tǒng)3基礎上成功構建了融合有HCV核心蛋白的重組表達質(zhì)粒pGBKT7核心蛋白，再將含HCV核心蛋白的重組質(zhì)粒轉化入Ura缺陷生長的AH109酵母菌中.通過Trp，Leu及His缺陷的營養(yǎng)篩選表明，帶Trp營養(yǎng)篩選標記的重組表達質(zhì)粒pGBKT7核心蛋白已成功轉化入帶有Ura營養(yǎng)篩選標記的AH109酵母菌中.帶有重組表達質(zhì)粒的AH109酵母菌在His營養(yǎng)缺陷的SD培養(yǎng)基上不能生長，說明構建的HCV核心蛋白對HIS3基因無激活作用.同時
7、β半乳糖苷酶印膜法及平板法檢測結果也表明構建的HCV核心蛋白對LacZ基因無激活作用.說明HBV核心蛋白對AH109無毒性，且對報告基因無自激活作用.這與體外構建質(zhì)粒共轉染實驗已經(jīng)證明的結果相似.這樣，我們就能利用核心蛋白為誘餌，從人cDNA文庫中去釣取與其相互作用的蛋白.HCV核心蛋白除了作為核殼蛋白具有病毒顆粒組裝功能外，還具有多種調(diào)控細胞、病毒基因表達及細胞生長以及免疫調(diào)節(jié)等功能.臨床和實驗研究顯示HCV感染與HCC發(fā)生發(fā)展過程密切相關，其中病毒核心蛋白起到重要的作用［6］.早期研究認為，HCV屬于非整合性R
