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《hcv核心蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達(dá)及自激活作用檢測》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、HCV核心蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達(dá)及自激活作用檢測作者：劉敏，張偉,陳天艷,藺淑梅,劉錦鋒,葉峰，趙英仁，張樹林【關(guān)鍵詞】蛋白 RoleofHCVcoreprotEininyeasttinreportergeneexpressionandactivation 【Abstract】AIM:ToconstructthebaitvectorofHCVcoreprotEIninyeasttandthentostudyitseffectonthegroentsencodingHCVcoreregionplifiedbyPCRandsubsequentl
2、yclonedintopUC19.Afterverifiedbysequencing,they.TheserebinantplasmidsentsofHCVcoreprotein3canbeutilizedtofishHCVcoreregioninteractingprotein.HCVcoreproteindoesnothaveselfactivatingfunction. 【Key;reportergene 【摘要】目的：檢測用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段構(gòu)建的酵母雙雜交誘餌載體的表達(dá)產(chǎn)物對酵母細(xì)胞有無毒性作用及對報告基因有
3、無激活作用.方法：PCR擴增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段，分別克隆入pUC19質(zhì)粒，經(jīng)測序正確后，再分別亞克隆入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中.將重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌AH109，檢測其表達(dá)產(chǎn)物在酵母細(xì)胞中對報告基因有無激活作用.結(jié)果：成功獲得含HCV核心蛋白的cDNA片段，HCV核心蛋白對酵母菌AH109無毒性，且對報告基因無激活作用.結(jié)論：利用酵母雙雜交Gal4系統(tǒng)3研究與HCV核心蛋白相互作用的蛋白,證實了HCV核心蛋白無自激活功能. 【關(guān)鍵詞】HCV核心蛋白；酵母雙雜交；報告基因 0引言 丙型肝炎病毒(hepatitisCvir
4、us,HCV)核心蛋白位于病毒多肽的氨基末端，被宿主的信號肽酶切割后產(chǎn)生.HCV核心蛋白除了作為核殼蛋白具有病毒顆粒組裝功能外，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、脂代謝、轉(zhuǎn)錄、免疫呈遞等作用［1］,其氨基酸序列高度保守，臨床和實驗研究顯示HCV核心蛋白具有廣泛的反式激活作用［2-3］，與宿主蛋白相互作用，可能是病毒感染導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因.酵母雙雜交系統(tǒng)是一種分析真核細(xì)胞中蛋白蛋白、蛋白DNA、蛋白RNA相互作用的基因分析方法.蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用是很多生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)［4］.酵母雙雜交Gal4系統(tǒng)3是在系統(tǒng)1和系統(tǒng)2基礎(chǔ)上的改進(jìn)，具有轉(zhuǎn)
5、化效率高，假陽性率低等優(yōu)點.我們利用它來克隆與HCV核心蛋白相互作用蛋白的基因，以期為HCV核心蛋白功能的研究提供新依據(jù). 1材料和方法 1.1材料 克隆有HCV全長cDNA的質(zhì)粒pCDNA3.0HCV由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室尹文博士惠贈；表達(dá)載體pGBKT7，AH109酵母菌種（美國Clontech公司）；質(zhì)粒pUC19菌種（本研究室保存）；PCR試劑盒、DNA重組所用的各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（Gibco公司）；DNA電泳膠回收試劑盒（上海華舜生物工程公司）；酵母培養(yǎng)試劑（美國Clontech公司）. 1.2方法 1.2.
6、1PCR擴增克隆編碼核心蛋白的引物為①引物P1:5′GCCGAATTCATGAGCACGAATCCTAAACCT3′；②引物P2:5′GCGTCGACTTAGGCTGAAGCGGGCACAGT3′.PCR反應(yīng)條件為：94℃30s,55℃60s,72℃60s,30個循環(huán). 1.2.2PCR產(chǎn)物克隆及鑒定純化的PCR產(chǎn)物用EcoRI和SalI雙酶切，定向克隆入pUC19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白篩選.酶切鑒定出含插入片段的陽性克隆命名為pUC19核心蛋白，進(jìn)行序列分析. 1.2.3構(gòu)建及鑒定誘餌載體用EcoRI，SalI酶切pUC19核心蛋
7、白和表達(dá)載體pGBKT7,回收核心蛋白及pGBKT7載體片段，載體片段與插入片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析，含正確插入片段的克隆命名為pGBKT7核心蛋白. 1.2.4轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞在1.5mL微量離心管中，加入已構(gòu)建好的誘餌載體0.1μg，鯡魚精DNA0.1mg和0.1mL酵母感受態(tài)細(xì)胞.混勻后加入0.6mLPEG/LiAc溶液.在30℃以200r/min振蕩培養(yǎng)30min,加入70mLDMSO后混勻,在42℃水浴15min,冰浴2min,5000r/min離心5s,去上清，以0.5mL1×TE重懸細(xì)胞后，鋪于SD/Trp
8、平板.于30℃培養(yǎng)36h左右，直至帶有誘餌載體的酵母克隆長出. 1.2.5蛋白表達(dá)的檢測 1.2.5.1
