wnt5a基因在乳腺癌中表達(dá)和臨床意義及其機(jī)制的研究

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1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文Wnt5a基因在乳腺癌中表達(dá)和臨床意義及其機(jī)制的研究姓名：嚴(yán)婷婷申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：陸勁松2012-04-10中文摘要復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文Wnt5a基因在乳腺癌中表達(dá)和臨床意義及其機(jī)制的研究目的在臨床上激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者的預(yù)后較陰性的患者好，激素受體陽(yáng)性也是運(yùn)用內(nèi)分泌治療的指征，因此調(diào)節(jié)激素受體的表達(dá)具有重要的臨床意義。miRNA-206通過與雌激素受體(ER)3’．非翻譯區(qū)結(jié)合從而抑制ER的表達(dá)。術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療聯(lián)合唑來膦酸研究結(jié)果顯示其可能具有直接的抗腫瘤作用以及增強(qiáng)內(nèi)分泌治療療效的作用。Wnt信號(hào)通路和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切

2、相關(guān)，其中Wnt5a的表達(dá)與乳腺癌激素受體表達(dá)密切相關(guān)，但是Wnt5a基因?qū)θ橄侔┥飳W(xué)行為影響、調(diào)控雌激素受體表達(dá)的機(jī)制以及唑來膦酸增強(qiáng)內(nèi)分泌療效的作用機(jī)制尚無深入研究。本課題旨在研究Wnt5a基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響和在乳腺癌中表達(dá)的臨床意義以及此基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)以及激素受體表達(dá)間的相關(guān)性，探索其調(diào)節(jié)雌激素受體表達(dá)可能的機(jī)制。方法第一部分1．設(shè)計(jì)并合成對(duì)人Wnt5a基因的RNA干擾片段，將siRNA片段瞬轉(zhuǎn)入ER陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞株下調(diào)其Wnt5a基因表達(dá)水平，用Western．blot方法驗(yàn)證下調(diào)Wnt5a蛋白表達(dá)的有效性，觀察下調(diào)此基因后對(duì)細(xì)胞ER

3、蛋白表達(dá)的影響；分別用CCK。8試劑盒以及Transwell小室測(cè)定Wnt5a基因下調(diào)后對(duì)細(xì)胞增殖水平以及體外侵襲能力的影響。2．用實(shí)時(shí)定量PCR(real．timePCR)檢測(cè)ER陽(yáng)性和ER陰性人乳腺癌細(xì)胞株miRNA．206表達(dá)差異以及下調(diào)ER陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞株Wnt5a基因表達(dá)水平后對(duì)rnjI斟A．206表達(dá)的影響。2中文摘要復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文3．用mimic．miRNA．206和inhibitor-miRNA．206瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ER陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞株，用real．timePCR驗(yàn)證上調(diào)和下調(diào)miRNA．206表達(dá)水平的有效性并觀察此小RNA表達(dá)水平的改變對(duì)Wnt5a以

4、及ER蛋白表達(dá)的影響。4．采用CCK-8試劑盒以及PI染色流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法(flowc”ometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)唑來膦酸對(duì)ER陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞增殖以及凋亡的影響。5．Western-blot法檢測(cè)唑來膦酸對(duì)ER陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞株ER、WntSa以及自噬蛋白表達(dá)水平的影響。6．CCK．8試劑盒檢測(cè)下調(diào)ER陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞Wnt5a基因后對(duì)唑來膦酸敏感性的影響7．透射電鏡觀察唑來膦酸誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬體。8．用CCK．8試劑盒檢測(cè)唑來膦酸聯(lián)合氟維斯群對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株增殖能力的影響，Western．blot法檢測(cè)兩藥聯(lián)合對(duì)乳腺癌細(xì)胞ER、Wnt5a蛋白表達(dá)的影響。第二部分《1

5、．收集乳腺癌患者741例以及對(duì)照良性乳腺疾病患者293例，病例組與對(duì)照組根據(jù)年齡匹配，簽署知情同意書后獲取外周血5ml。京2．提取外周血DNA，對(duì)于Wnt5a的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。候選SNP位點(diǎn)由ABI公司開發(fā)的SNPbrowserTMv4．0軟件來選擇。3．對(duì)于Wnt5a基因多態(tài)性位點(diǎn)與乳腺癌易感性以及乳腺癌患者中Wnt5a基因多態(tài)性與臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。第三部分收集2005年01月～2005年12月間復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理確診的女性原發(fā)性乳腺癌標(biāo)本218例臨床病理資料和腫瘤組織蠟塊標(biāo)本，對(duì)所有入組病例進(jìn)行隨訪，運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)乳

6、腺癌腫瘤組織中Wnt5a的表達(dá)。研究Wnt5a的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系。分析其表達(dá)與臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)。生存曲線用Kaplan．Meier法計(jì)算。多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析采用statal0．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3中文摘要復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文結(jié)果；日爿K第一部分1．下調(diào)MCF．7細(xì)胞Wnt5a基因表達(dá)水平后可以抑制ER蛋白的表達(dá)，并且可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，但對(duì)細(xì)胞侵襲能力無影響。2．ER陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株MCF．7的miRNA．206表達(dá)水平低于ER陰性的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-2

7、31細(xì)胞株；下調(diào)MCF．7細(xì)胞Wnt5a基因表達(dá)后miRNA．206表達(dá)增高。3．上調(diào)MCF一7細(xì)胞miRNA-206表達(dá)后可抑制其Wnt5a以及ER蛋白的表達(dá)水平；抑制MCF-7細(xì)胞miRNA．206表達(dá)后對(duì)Wnt5a以及ER蛋白表達(dá)無明顯影響。4．唑來膦酸可以抑制MCF．7細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡并且具有濃度依賴性。5．唑來膦酸可以抑制MCF．7細(xì)胞株的Wnt5a以及ER蛋白的表達(dá)，另外還可以誘導(dǎo)自噬標(biāo)記蛋白LC3．II表達(dá)增多。6．下調(diào)MCF．7細(xì)胞株的Wnt5a基因表達(dá)水平后對(duì)唑來膦酸的敏感性降低。7．透射電鏡