《親和層析》PPT課件

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1、第七章親和層析Affinitychromatography8/5/20211技術(shù)背景各種大分子物質(zhì)之間理化特性的差異性。但如果這種差異性較小，純化較麻煩，最終收得率很低。8/5/20212內(nèi)容提要第一節(jié)基本原理第二節(jié)操作第三節(jié)提高吸附劑的操作容量第四節(jié)應(yīng)用實例8/5/20213第一節(jié)基本原理蛋白質(zhì)2與配體無生物學(xué)特異性12LMS8/5/20214一、親和層析的概念親和力根據(jù)生物體中高分子化合物能與之相對應(yīng)的專一分子特異識別和可逆結(jié)合的特征，將生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。8/5/20215親和層析法利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性

2、吸附而進(jìn)行選擇性分離的一種生物大分子分離的層析方法。8/5/20216親和層析法的實質(zhì)是在載體(無機或有機填料)的表面先鍵和一種具有一般反應(yīng)性能的間隔臂，隨后再連接配體（酶、抗原、激素等）組成固定相,配體高選擇地吸附與其有生物特性的大分子而被保留,非特異的分子不被保留先流出層析柱，保留在柱上的分子將以純品形態(tài)洗脫下來。8/5/202178/5/202188/5/202198/5/202110■二、親和層析法的作用機理固相載體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團(tuán)配體XBAA8/5/2021118/5/2021

3、12特異性配體親和層析法和通用性配體親和層析法：方法配體性能特異性配體親和層析法復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)（如抗體、受體和酶的類似底物等）具有較強的吸附選擇性和較大的結(jié)合力通用性配體親和層析法簡單的小分子物質(zhì)（如金屬、染料、以及氨基酸等）成本低廉，具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的分辨率8/5/202113三、親和層析具備的三要素介質(zhì)(基質(zhì))—具有活化基團(tuán)間隔臂—連接介質(zhì)與配體的分子配體—具有識別能力反配體（分離物）—與配體進(jìn)行可逆結(jié)合8/5/202114■四、親和層析法的四要點(2)SpecificBindingSubstanc

4、e(S)溶解Elution(4)配體Ligand(L)偶合反應(yīng)(3)CouplingReaction雜質(zhì)SSSS(1)SolidMatrixS8/5/202115五、親和層析的特點條件溫和：不影響樣品的生物活性，適合生物大分子的操作。純化效率高：一步法分離和純化混合物中的樣品，提純達(dá)幾千倍,得到高純度樣品。選擇性強：依據(jù)生物學(xué)特異性，而非物理化學(xué)性質(zhì)分離原理。故特異的層析圖為2個峰，第1個為雜峰，第2峰為純品。8/5/202116Activity■典型的親和層析操作：ElutionvolumeProteinpH2.05*8/5/202117五、

5、親和層析的特點柱層析柱小Vt＝1～1.5ml。上樣量大,達(dá)1/2Vt體積并對樣品的濃度與純度要求不高。操作簡單，時間快速。柱子填充載體昂貴，配體的特異性，有時找不到適宜的配體，不適合所有生物大分子樣品。PriboFast?黃曲霉毒素B1免疫層析親和柱8/5/202118內(nèi)容提要第一節(jié)基本原理第二節(jié)操作第三節(jié)提高吸附劑的操作容量第四節(jié)應(yīng)用實例8/5/202119二、配基（配體）的選擇第二節(jié)操作一、理想基質(zhì)的性質(zhì)優(yōu)良的配體必須具備兩個條件：配體與生物大分子具有合適的親和力；配體具有與載體牢固地結(jié)合，又不影響與生物大分子之間的親和力。8/5/2021

6、20常用配體分離對象酶蛋白基質(zhì)類似物、抑制劑、輔酶、底物、產(chǎn)物等抗體抗原、病毒、細(xì)胞外源凝集素多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體、結(jié)合蛋白核酸互補堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶、結(jié)合蛋白激素及維生素受體、載體蛋白細(xì)胞細(xì)胞表面特異性蛋白、外源凝集素專一性結(jié)合的生物體系8/5/202121配體待純化的蛋白質(zhì)配體待純化的蛋白質(zhì)抗原特定單克隆抗體或多克隆抗體肝素凝聚因子、脂酶、結(jié)締組織蛋白酶、DNA聚合酶單克隆抗體特定抗原膽固醇膽固醇受體、膽固醇結(jié)合蛋白蛋白質(zhì)A/蛋白質(zhì)G免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸結(jié)合蛋白、白蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶核苷酸核苷酸結(jié)合蛋白、需核苷酸的酶磷

7、酸磷酸酶苯基硼酸鹽糖蛋白三嗪染料脫氫酶、激酶、聚合酶、限制酶、干擾素凝集素糖蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶糖凝集素、糖苷酶蛋白質(zhì)親和層析中的合適配體8/5/202122三、親和吸附劑的制備載體的活化（CNBr）配體的偶聯(lián)結(jié)合能力的測定用溴化氰活化載體8/5/2021238/5/202124四、特異性吸附欲分離物質(zhì)與親和吸附劑結(jié)合，當(dāng)結(jié)合力較強時，配體與有效成分緊密結(jié)合，隨著樣品的加入，親和成分恒定增加并不斷地吸附上柱，形成致密的復(fù)合物帶，使吸附容量增至最大，達(dá)到飽和。影響吸附容量除親和力外和還與pH、離子強度有關(guān)。復(fù)合物帶8/5/202125樣品

8、中有效成分在親和吸附劑上的吸附量，除了與它們之間的親和力有密切關(guān)系外，還與樣品的pH值和離子強度有關(guān)系。8/5/202126五、層析步驟樣品制備結(jié)合步