細(xì)胞破碎18020

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1、幾種由大腸桿菌表達(dá)的胞內(nèi)重組藥物藥物名稱(chēng)宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長(zhǎng)激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病α-干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟(jì)肉瘤細(xì)胞破碎概述細(xì)胞破碎（cellrupture）技術(shù):利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)。細(xì)菌細(xì)胞壁G+菌：20～80nm的肽聚糖層G-菌:脂類(lèi)含量較高破碎細(xì)菌細(xì)胞的主要阻力肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度酵母細(xì)胞壁破碎酵母細(xì)胞的阻力葡聚糖交聯(lián)的緊密程度和它的厚度霉菌細(xì)胞壁葡聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的交聯(lián)度幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)破碎霉菌細(xì)胞的

2、阻力植物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)已生長(zhǎng)結(jié)束的植物細(xì)胞壁：初生壁，次生壁植物細(xì)胞初生壁的化學(xué)組成組分結(jié)構(gòu)和分類(lèi)纖維素β－1，4－D－葡聚糖半纖維素木葡聚糖甘露聚糖木聚糖(包括阿拉伯木聚糖和4-0-甲基-葡萄糖醛酸木聚糖）果膠物質(zhì)半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白各種酶類(lèi)凝集素一、機(jī)械法高壓勻漿破碎法（homogenization）高速攪拌珠研磨破碎法（finegrinding）超聲波破碎法（ultrasonication）1.高壓勻漿器（Highpressurehomogenizer）操作原理在高壓下迫使細(xì)胞漿液在排出閥的小孔中高速

3、沖出，并射向撞擊環(huán)上，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。操作方式：?jiǎn)未位蚨啻窝h(huán)出口溫度：20℃左右壓力：55－70Mpa適用范圍酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎。料液細(xì)胞濃度：20%左右?！顖F(tuán)狀和絲狀菌，不宜使用。注意事項(xiàng)（1）操作溫度：↑２－３℃/10MPa（2）對(duì)料液作冷卻處理。（3）多組破碎操作中需要在級(jí)間設(shè)置冷卻裝置可有效防止溫度上升，保護(hù)產(chǎn)物活性。2.珠磨機(jī)研磨：將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得破碎。工作原理細(xì)胞的破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動(dòng)而引起。磨室配有冷卻夾套3.超聲波破碎利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kH

4、z的超聲波處理細(xì)胞懸浮液。超聲波振蕩器的組成：發(fā)生器和換能器，機(jī)理在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。破碎效率與細(xì)胞種類(lèi)、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。適用范圍很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。對(duì)冷卻的要求苛刻，不易放大，用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。二、非機(jī)械法⑴酶解⑵滲透壓沖擊⑶凍結(jié)和融化⑷干燥法⑸化學(xué)法溶胞1.酶解（酶溶法Enymaticlysis)利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。特點(diǎn)條

5、件溫和選擇性地釋放產(chǎn)物胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整，便于后步分離等價(jià)格高2.滲透壓沖擊法較溫和高滲溶液→快速稀釋?zhuān)鸺?xì)胞快速膨脹破裂。3.凍結(jié)-融化法將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體。4.化學(xué)法采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分。常用酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等三、目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物，盡量少地釋放其它物質(zhì)，并且盡量降低細(xì)胞的破碎程度。一般原則⑴僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周?chē)?xì)胞膜附近：酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結(jié)－融化法等。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)：機(jī)械破碎法．（2）選擇性溶

6、解目標(biāo)產(chǎn)物四、包含體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞介素－６、人γ－干擾素等）在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒(méi)有生物活性的固體顆粒－包涵體。（inclusionbodiesIBs)蛋白0產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長(zhǎng)激素>30%形成包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體包含體的構(gòu)成大多是基因表達(dá)產(chǎn)物，無(wú)定形的蛋白質(zhì)的聚集。一級(jí)結(jié)構(gòu)正確，但立體結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤，無(wú)生物活性?；蚬こ贪w的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性

7、溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性目標(biāo)蛋白的復(fù)性包涵體難溶于水，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，蛋白質(zhì)所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，但一級(jí)結(jié)構(gòu)不被破壞。當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)的復(fù)性。路線（一）機(jī)械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）離心提取出包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性路線1的特點(diǎn)特點(diǎn):用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開(kāi)缺點(diǎn):要經(jīng)過(guò)幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長(zhǎng)。路線（二）機(jī)械破碎膜分離除可溶性蛋白加變性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性路線2的特點(diǎn)用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但細(xì)胞碎片卻和