層析介質(zhì)的壽命與層析介質(zhì)的清洗驗(yàn)證

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1、層析介質(zhì)的壽命與層析介質(zhì)的清洗驗(yàn)證前言在近20-30年生物技術(shù)在中國(guó)得到了迅猛的發(fā)展。隨著生物制藥技術(shù)的發(fā)展，生物藥物的質(zhì)量越來(lái)越得到重視。生物藥物從研究到上市，其過(guò)程包括，實(shí)驗(yàn)室成果轉(zhuǎn)化到臨床試驗(yàn)，最終由患者廣泛應(yīng)用。藥物研發(fā)成功的關(guān)鍵是藥物的有效性，同時(shí)藥物的安全性更為重要。我們需要在嚴(yán)格確保高質(zhì)量的同時(shí)，不影響其有效性及工藝的穩(wěn)定性。這就是法規(guī)部門的要求。清洗驗(yàn)證是工藝驗(yàn)證中的一項(xiàng)重要部分，驗(yàn)證是cGMP所要求的“證明任何程序、生產(chǎn)過(guò)程、設(shè)備、物料、活動(dòng)或系統(tǒng)確實(shí)能導(dǎo)致預(yù)期結(jié)果的有文件證明的一系列活動(dòng)”。在生物藥

2、物的生產(chǎn)過(guò)程中，層析技術(shù)是其中最關(guān)鍵的步驟。生物藥物通過(guò)培養(yǎng)，收集，經(jīng)過(guò)層析介質(zhì)的純化，最終得到符合要求的生物藥物產(chǎn)品。在生物制藥的分離純化過(guò)程中，培養(yǎng)的物料通過(guò)層析介質(zhì)分離純化，得到符合要求的目標(biāo)產(chǎn)品。同時(shí)，物料中的雜質(zhì)也污染了層析介質(zhì)。這些污染物包括：宿主的蛋白、核酸、脂類，培養(yǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物、內(nèi)毒素、雜菌以及可能的層析系統(tǒng)的泄漏，試劑中的雜質(zhì)。這些污染物在下一次的分離純化中將污染目標(biāo)產(chǎn)品。所以必須去除或?qū)⑵浣档偷桨踩?。這就是我們所提到的層析介質(zhì)的清洗(CIP)過(guò)程。通過(guò)您的試驗(yàn)證明清洗有效且污染物的殘留已經(jīng)

3、降低到安全水平的工作就是清洗驗(yàn)證。層析介質(zhì)是一種消耗品，層析介質(zhì)的經(jīng)過(guò)一段時(shí)間使用，清洗后，污染物的殘留量超過(guò)了安全水平，那么層析介質(zhì)的壽命就到期了，只有更換新的層析介質(zhì)才能保證生物藥品的質(zhì)量。1、層析介質(zhì)壽命的影響因素：●物料的類型以及該層析介質(zhì)所在工藝中純化步驟●層析介質(zhì)的類型●層析柱的維護(hù)●整個(gè)層析系統(tǒng)的組成●層析柱的裝柱質(zhì)量●試劑等的質(zhì)量1.1物料的類型:物料是指生物生產(chǎn)過(guò)程中含有目標(biāo)產(chǎn)品的料液。物料的類型是影響層析介質(zhì)壽命的關(guān)鍵因素。不同的物料中含有的雜質(zhì)不同。如：大腸桿菌的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液的上清液中約為10

4、種蛋白，在外膜與內(nèi)膜間的胞質(zhì)中約含100種蛋白質(zhì)，而細(xì)胞膜內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)中含有2000種蛋白質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中還含有核酸、脂類等非蛋白的雜質(zhì)。所以如果您的物料是大腸桿菌的細(xì)胞破碎液，那么雜質(zhì)就相當(dāng)?shù)亩嗔恕Ｓ捎诘鞍椎姆N類不同，所以在分離您的目標(biāo)蛋白的時(shí)候，這些雜質(zhì)可能發(fā)生沉淀、變性、聚集等變化，污染堵塞層析介質(zhì)。又如：在抗體生產(chǎn)中使用ProteinA介質(zhì)純化。物料是CHO細(xì)胞表達(dá)的上清液。在培養(yǎng)過(guò)程中如果培養(yǎng)的條件控制較好，上清液的雜質(zhì)相對(duì)較少，此ProteinA的介質(zhì)壽命就會(huì)較長(zhǎng)。但是如果CHO細(xì)胞培養(yǎng)條件控制不好，細(xì)胞裂解，

5、細(xì)胞中的蛋白/核酸等雜質(zhì)就會(huì)影響純化的條件，介質(zhì)的壽命就會(huì)受到影響。如果想要延長(zhǎng)介質(zhì)的使用壽命，就必須使用較強(qiáng)烈的清洗條件清洗層析介質(zhì)。例如:NaOH或優(yōu)化清洗劑的條件等。Streamline介質(zhì)的設(shè)計(jì)用于捕獲步驟，所以此介質(zhì)易受雜質(zhì)的污染，在清洗時(shí)需優(yōu)化清洗試劑及步驟。物料：雜交瘤細(xì)胞上清層析介質(zhì)：STREAMLINErProteinA在位清洗步驟：?A:1.0mMNaOH，2MNacl溶于20%的乙醇中，處理2小時(shí)，2500px/h流速?B:5%月桂酰肌氨酸鈉，20mMEDTA，0.1MNaCl，20mMNaH2P

6、O4,pH7.5處理1.5小時(shí)?C:50mMHAC，20%乙醇1.2層析介質(zhì)所在的純化工藝中的步驟：在純化的工藝開發(fā)過(guò)程中，我們建議采用三步法純化工藝。捕獲→中度純化→精純→半成品。在三步純化工藝中，不同的純化步驟，其純化工作的目的不同。捕獲步驟主要的目的是：從大量的雜質(zhì)中捕獲目標(biāo)樣品，縮小樣品的體積，以便于后續(xù)的純化工作。所以此步驟的工作面臨的是物料中有大量雜質(zhì)。所以此步驟層析介質(zhì)的清洗需要比較強(qiáng)烈的試劑，因此捕獲步驟的層析介質(zhì)的壽命相對(duì)較短。在表1中血漿白蛋白純化過(guò)程中使用的離子交換介質(zhì)在不同的分離步驟中，DEAE

7、SepharoseFastFlow陰離子交換介質(zhì)，在此工藝中為捕獲作用；CMSepharoseFastFlow為陽(yáng)離子交換介質(zhì)，工藝中為中度純化；這兩步離子交換均為3個(gè)循環(huán)做一次CIP。但是用于捕獲步驟的陰離子交換介質(zhì)DEAESepharoseFastFlow的壽命明顯短于中度純化的CMSepharoseFastFlow介質(zhì)。1.3不同類型的層析介質(zhì)：層析介質(zhì)是由層析介質(zhì)的基價(jià)(骨架)配合各種配基形成不同原理的層析介質(zhì)。凝膠過(guò)濾介質(zhì)沒(méi)有配基；離子交換、疏水的配基為小分子的配基;親和介質(zhì)的配基一般為特殊的蛋白質(zhì)。親和介質(zhì)

8、的配基一般穩(wěn)定性稍差，不耐受酸、堿等較強(qiáng)的清洗條件，所以對(duì)清洗的條件要求比較嚴(yán)格，較強(qiáng)的試劑清洗可能導(dǎo)致配基的脫落或降解。但是溫和的試劑的清洗效果較差，這就造成層析介質(zhì)的壽命縮短。MabselectSuRe為新一代重組ProteinA的親和介質(zhì)。對(duì)原有的ProteinA的氨基酸序列作了突變。使其耐受0.1-0.5MNaOH，從而可