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《親和層析法純化胰蛋白酶》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、親和層析法純化胰蛋白酶第一部分實驗內(nèi)容簡介1內(nèi)容摘要親和層析包括了一整套復(fù)雜的底物及其配體與生物大分子之間相互作用時所形成的獨特的生物學(xué)特性。在親和結(jié)合的過程中涉及到疏水力、靜電力、范德華力及空間阻力等因素的影響。親和層析的概念可以理解為配基以共價鍵的形式與水不溶性固體載體共價結(jié)合，形成具有高度專一性的親和吸附劑。以該介質(zhì)為填料填充親和層析柱，從復(fù)雜的混合物中有針對性分離某一種成分。本實驗以親和層析方法分離純化豬胰蛋白酶為目的，從豬胰臟提取液中分離純化胰蛋白酶，最終得到純度較高的胰蛋白酶。圍繞親和層析實驗所涉及的蛋白質(zhì)和酶基本
2、性質(zhì)及相關(guān)技術(shù)進行綜合訓(xùn)練。其中主要包括親和層析介質(zhì)配基的制備，親和介質(zhì)的合成，蛋白質(zhì)和酶的分離純化，酶活性的測定等內(nèi)容。通過綜合訓(xùn)練，能夠系統(tǒng)掌握蛋白質(zhì)制備的基本原理和操作，學(xué)習(xí)如何進行實驗設(shè)計，掌握實驗過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對實驗中出現(xiàn)的問題進行科學(xué)的分析。使學(xué)生在學(xué)習(xí)實驗技術(shù)的同時，自覺培養(yǎng)分析問題和解決問題能力。2實驗?zāi)康姆椒ㄕ莆盏鞍踪|(zhì)分離純化的基本原理與操作技術(shù)掌握親和層析的基本原理及親和介質(zhì)合成技術(shù)掌握胰蛋白酶活性及抑制活性測定的原理和方法掌握消光系數(shù)法測定蛋白質(zhì)的原理及計算方法1.3實驗流程雞蛋清Spharose4B
3、豬胰臟↓↓↓提取↓活化提取分離純化↓↓↓純卵粘蛋白(CHOM)→←活化Spharose4B胰蛋白酶原粗提液↓↓偶聯(lián)激活↓↓CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液↓親和層析↓酶促動力學(xué)←純胰蛋白酶→酶活性測定↓酶蛋白含量測定1.4要求掌握的技術(shù)柱層析技術(shù)SephadexG-25分子篩層析DEAE-Cellulose離子交換層析CHOM–Sepharose4B親和層析蛋白質(zhì)提取技術(shù)10%TCA提取雞卵粘蛋白3.5%乙酸,pH3.0提取胰蛋白酶原蛋白含量測定技術(shù)消光系數(shù)法測定胰蛋白酶含量消光系數(shù)法測定雞卵粘蛋白含量生物活性
4、測定胰蛋白酶比活性測定雞卵粘蛋白抑制活性測定親和介質(zhì)合成技術(shù)載體-Sepharose4B的前處理載體-Sepharose4B的活化活化載體-Sepharose4B的偶聯(lián)第二部分實驗方法實驗一雞卵粘蛋白的分離純化1雞卵粘蛋白的基本性質(zhì)1.1雞卵粘蛋白的組成分子量:28000Da分子組成:四個分子量相近的亞基組成糖蛋白糖基部分:D-甘露糖,D-半乳糖,葡萄糖胺,唾液酸1.2化學(xué)穩(wěn)定性耐熱:在80℃條件下,理化性質(zhì)不發(fā)生改變耐有機溶劑:在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度耐沉淀劑:在10%的TCA的溶液中不發(fā)生沉淀.1.3等電點
5、性質(zhì)等電點:pI在3.9-4.5之間溶液中的狀態(tài):在pH3.0的溶液中穩(wěn)定,在pH8.0的溶液中容易分解雞卵粘蛋白在10%的TCA不同pH值的溶液中的溶解狀態(tài)見表1。表1，雞卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度溶液pH值雞卵粘蛋白雞卵清蛋白等于3.5沉淀5%溶解95%沉淀95%溶解5%低于3.5沉淀↑溶解↓沉淀↑溶解↓高于3.5沉淀↓溶解↑沉淀↓溶解↑1.2.雞卵粘蛋白的提取2.1提?。好拷M發(fā)給50毫升的雞卵清加入一定體積的10%pH1.15TCA溶液(輕輕攪拌一邊攪拌一邊加入),攪勻后用pH試紙檢查pH值,待pH穩(wěn)定在3.5
6、±0.2后放置4℃冰箱過夜.2.2離心：轉(zhuǎn)移50毫升離心杯中,于3000rpm離心15min。2.3過濾：傾出上清液，濾紙過濾，濾去上浮脂類物質(zhì)和不溶物2.4調(diào)pH值：用1mol/LHCl將溶液精確調(diào)至pH3.5。量取體積。2.5丙酮沉淀：緩緩加入三倍體積預(yù)冷的丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴，放置冰箱內(nèi)靜止4小時。2.6離心：虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到50ml離心杯中，于3000rpm離心15min。2.7除殘留丙酮：棄去上清液，將盛有沉淀的離心杯至于真空干燥器中。抽去殘留丙酮。（沉淀物的顏色由白變成透明膠狀物即可）2.8溶
7、解：加入25ml蒸餾水或20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液溶解，濾紙過濾，收集濾液，備用。3雞卵粘蛋白的分離純化3.1SephadexG-25柱脫鹽(1)溶脹：稱取15gSephadexG-25放入500ml的燒杯中,加入200ml蒸餾水，在室溫下溶脹24小時或在沸水浴中溶脹2小時。(2)裝柱：取一支30×3cm的層析柱，將溶脹好的SephadexG-25裝柱，自然沉降。(3)處理：用2倍柱床體積的0.5mol/LNaCl溶液洗柱，2倍體積的蒸餾水洗去殘留的NaCl。(4)平衡：用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡
8、，流速控制在1.0-1.5ml/min。紫外檢測儀檢測柱內(nèi)平衡狀態(tài)，直到儀器繪出穩(wěn)定的基線。(5)上樣：將柱內(nèi)的緩沖液液面流至于膠面相切，取20ml雞卵粘蛋白提取液上樣，待樣液液面流至于膠面相切，加入2-3ml緩沖液沖洗層析柱內(nèi)壁，待溶液液面流至于膠面相切，然后加入緩沖液距膠
