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1、生物工程學(xué)報(bào)一,翻‘’班’一淀粉酶和糖化酶在釀酒酵母中的表達(dá)和分泌羅進(jìn)賢何鳴李文清張?zhí)碓?廣州山大學(xué)生物工程研究中心。一淀粉酶一摘要將地衣芽抱桿菌基因及黑曲霉糖化酶重組進(jìn)大腸桿菌酵母穿梭質(zhì),,。粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母構(gòu)建能分解淀粉的酵母工程菌酶活力測(cè)定和酶學(xué)性質(zhì)分析的結(jié)果顯示一,一在酵母因子及磷酸甘油酸激酶基因的啟動(dòng)子和終止信號(hào)的調(diào)控下淀粉酶和糖化酶基因在酵母中獲得高表達(dá)并向胞外分泌這兩種酶。構(gòu)建的酵母工程菌在含淀粉的培養(yǎng)基中天內(nèi)能水解的淀粉,重組質(zhì)粒能在酵母中較穩(wěn)定地存在。關(guān)鍵詞一淀粉酶,糖化酶,基因表達(dá),釀酒酵母一近年來(lái)國(guó)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室先后把各種來(lái)源的淀粉酶基因和葡
2、萄糖淀粉酶糖化一‘’,。。一酶基因引入釀酒酵母構(gòu)建能分解淀粉的菌株我們?cè)鴮⒌匾卵勘U菌淀粉酶基·〔‘,?！?呂〕,。一因及黑曲霉糖化酶的轉(zhuǎn)入釀酒酵母獲得表達(dá)和分泌本文報(bào)道將淀,,一粉酶基因和糖化酶的重組于同一酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母利用酵母,一因子及磷酸甘油酸激酶基因的調(diào)控序列實(shí)現(xiàn)淀粉酶和糖化酶在釀酒酵母中,。同時(shí)表達(dá)和分泌構(gòu)建的酵母工程菌能高效分解淀粉材料和方法材料一〔幻。。地衣芽飽桿菌淀粉酶荃因和黑曲霉糖化酶為本課題組克隆獲得表菌株和質(zhì)粒一〔一,飛,乙‘七‘硯藝一,,奮一,一。奮一,,資〔〕‘刀‘七‘“‘,,矛丙妙尸紐一資山〕一‘,,拜,是一】」一‘,,、·
3、,入拜加廣東省自然科學(xué)基金資助。本文于年月日收到。生物工程學(xué)報(bào)卷菌株與質(zhì)粒本研究所用菌株和質(zhì)粒如表,一是含地衣芽袍桿菌一,淀粉酶基因的大腸桿菌酵母穿梭質(zhì)粒是含黑曲霉糖化酶的大腸桿菌一酵母穿梭質(zhì)粒。,培養(yǎng)基大腸桿菌的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基酵母的培養(yǎng)和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化用的培養(yǎng)基有、、、、及等培養(yǎng)基,其成分見(jiàn)文獻(xiàn)。〔〕、一生化試劑限制酶記皿連接酶為公司產(chǎn)品低融點(diǎn)瓊脂糖、、等分別購(gòu)自公司和公司,其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭７椒ā?‘,,質(zhì)粒的檢測(cè)和制備大腸桿菌質(zhì)粒的檢測(cè)和制備按的方法酵母質(zhì)一。飛、粒的檢測(cè)按的方法川質(zhì)粒的酶解、酶解片段的回收參照文獻(xiàn)〔的的方法。’‘,,分子的連接和大腸
4、桿菌轉(zhuǎn)化按的方法酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化按的方法’〕。淀粉酶陽(yáng)性菌落的檢測(cè)和酶活力測(cè)定見(jiàn)文獻(xiàn)〔〕。一個(gè)酶活力單位定義為’,的條件下每小時(shí)產(chǎn)生葡萄糖的酶量。淀,粉水解產(chǎn)物的紙層析鑒定取適量的培養(yǎng)上清液與可溶性淀粉混勻在‘’,,,以正丁醇毗咤,一的條件下保溫小時(shí)在新華號(hào)濾紙上點(diǎn)樣水,,,上,一,,為展開(kāi)劑進(jìn)行紙層析行次用苯胺鄰苯二甲酸顯色與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較分析水解產(chǎn)物的成分?！??！病撑囵B(yǎng)液中剩余淀粉含量的測(cè)定和重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性檢測(cè)參考的方法結(jié)果一。含淀粉酶和糖化酶基因的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建。一,為使淀粉酶和糖化酶基因能在釀酒酵母中同時(shí)表達(dá)將這兩個(gè)基因重組進(jìn)同一酵,。。一一,母質(zhì)
5、粒構(gòu)建表達(dá)載體地衣芽抱桿菌的淀粉酶基因位于質(zhì)粒上該基因一一二‘〕。。在因子的啟動(dòng)子和信號(hào)序列的調(diào)控下已在釀酒酵母中表達(dá)和分泌如圖所,一一示用二班把質(zhì)粒八〔上的含啟動(dòng)子糖化酶終止序列的的片一段切出低融點(diǎn)瑪〔脂糖凝膠電泳分離,然后將此的片段以適當(dāng)一,比例與經(jīng)盯酶解的質(zhì)?；旌嫌眠B接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。在氨節(jié)青毒素平板二篩選轉(zhuǎn)化子并經(jīng)質(zhì)?？焖贆z測(cè)找出含插入片段的重組子圖一〕,是重組質(zhì)粒及和的皿酶解片段的凝膠電泳圖經(jīng)皿酶切后產(chǎn)生條帶,分別為、和其中的帶是含糖化酶,,及啟動(dòng)子和終止序列的片段重組質(zhì)粒經(jīng)皿酶解后產(chǎn)生兩條帶大的帶一坦,皿與的酶解片段相同小帶來(lái)自經(jīng)酶切后產(chǎn)生的片
6、段。這一結(jié)果表明,含黑曲毒樹(shù)化酶的片段已重組進(jìn)質(zhì)粒一,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為。一淀粉酶和糖化酶在釀酒酵母中的表達(dá)和分泌用,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的表達(dá)載體引入釀酒酵母在缺亮氨期。一羅進(jìn)賢等淀粉酶和糖化酶在釀酒酵母中的表達(dá)和分泌石曰,加,七日壇皿。叫因口刀功,訪,圖質(zhì)粒的構(gòu)建、萬(wàn)·、一、一習(xí)記記℃飛一、〔一一記酸的再生培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)點(diǎn),于缺亮氨酸的淀粉培養(yǎng)基上同時(shí)點(diǎn)一,及受體菌作對(duì)照,℃培養(yǎng)天,倒碘,液于平板上可見(jiàn)在、及菌落周圍都出現(xiàn)淀粉水解后產(chǎn)生的透明圈圖,在該平板上不生長(zhǎng),而且形成的透明圈比一及的大,顯示前者的酶活較高。為了研究酶的分泌情況,將以上酵母轉(zhuǎn)
7、圖重組質(zhì)粒的酶切分析一。、化子的單菌落接種于含葡萄糖的培八,,養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)小時(shí)離心收集細(xì)入入萬(wàn),,一,,胞轉(zhuǎn)至不含葡萄糖的培養(yǎng)基中生物工程學(xué)報(bào)卷℃振搖小時(shí),,,離心測(cè)定上清液中的酶活同時(shí)將菌體用蝸牛酶和超聲波裂解后測(cè)定胞內(nèi)酶活力,結(jié)果如表。表顯示含。一淀粉酶、糖化酶雙基因的轉(zhuǎn)化子的酶活力比含一一,淀粉酶或糖化酶單基因的轉(zhuǎn)化子一及都高而且酶活力基本上分泌到胞外。一表釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的酶活力為了進(jìn)一步確認(rèn)淀粉酶和習(xí)衛(wèi),朽糖化酶基因已在酵母中同時(shí)表達(dá)把的培養(yǎng)上君產(chǎn)“、“】】】】清液用飽和度的一一曰兩,甘曰︺材曰自止鹽析后上纖維素柱層析進(jìn),,??行初步純化用法測(cè)酶活分別
8、從上柱流出液及的洗脫液中
