親和層析技術(shù)要點(diǎn)

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1、親和層析純化技術(shù)要點(diǎn)6thGroup小組成員:徐鵬，蔣美玲，季成，滕嘉琳，金爽，任沛生物制藥工藝上主要運(yùn)用的幾種色譜技術(shù)分配色譜吸附色譜離子交換色譜親和色譜凝膠色譜色譜技術(shù)6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogoAffinityChromatography親和層析技術(shù)概述1親和層析基本過(guò)程2His-tag親和層析常見(jiàn)問(wèn)題3Tips46thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo親和層析技術(shù)概述WhatisAffinityChromatography?親和層析是利用生物體中多數(shù)大分子物質(zhì)具有與

2、某些相應(yīng)的分子專一性可逆結(jié)合的特性而建立的分離純化技術(shù)其專一性是由分子有關(guān)作用基團(tuán)（官能團(tuán)）的化學(xué)結(jié)構(gòu)與它們的空間排列決定的親和層析技術(shù)是目前分離純化藥物蛋白等生物太分子最重要的方法之一6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogoBackground生物大分子自身的特殊性和復(fù)雜性：熱穩(wěn)定性差，對(duì)環(huán)境的pH值、有機(jī)溶劑、某些無(wú)機(jī)載體和金屬離子很敏感。因此欲高效分離純化存在于相當(dāng)大體積的組織勻漿或發(fā)酵液中的極少量目標(biāo)產(chǎn)物，同時(shí)又混有大量理化性質(zhì)相仿的其它生物活性物質(zhì)時(shí)，僅根據(jù)理化性質(zhì)不同設(shè)計(jì)分離純化工藝已遠(yuǎn)不能滿足生物技術(shù)發(fā)展的需

3、要。這時(shí)就必須從生物親和作用力的角度進(jìn)行研究，而親和技術(shù)正是在此背景下產(chǎn)生的。6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo聚苯乙烯載體連接上抗原，分離血液中相應(yīng)的抗體用淀粉裝柱來(lái)分離淀粉酶——第一次認(rèn)識(shí)到親和層析瓊脂糖載體取代聚苯乙烯載體，使親和層析得到高速發(fā)展，成為“第二大類”分離純化手段，應(yīng)用廣泛，親和對(duì)眾多。親和層析發(fā)展史1910195519676thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo基本概念親和作用：生物物質(zhì)具有識(shí)別特定物質(zhì)并與該物質(zhì)分子結(jié)合的能力，且可以區(qū)分結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相似的其他分

4、子，這種特異性的相互作用稱為親和作用。配基:親和層析中能被某一生物大分子識(shí)別和可逆結(jié)合的生物專一性物質(zhì)。配體：與配基是相對(duì)的概念。6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo配基應(yīng)具備的特性：1.對(duì)于欲純化的生物物質(zhì)應(yīng)具有專一親和性2.必須具備能被修飾的功能基團(tuán)常見(jiàn)配基-配體物質(zhì)對(duì)：酶-底物酶-抑制物激素-受體抗原-抗體金屬離子-氨基酸殘基cDNA-對(duì)應(yīng)的基因片段，等6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo親和層析的特點(diǎn)親和層析通用性差，洗脫不緩和高度特異性高效能操作簡(jiǎn)便快速親和力緩和應(yīng)用

5、廣泛6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo親和層析基本過(guò)程?配基固定化(Immobilise)基質(zhì)Matrix(載體):親和層析中與配基共價(jià)結(jié)合,使其固相化的物質(zhì)。6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo?吸附(Adsorption)?洗脫(Elution)6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo洗脫elution洗滌wash上樣Sampleapplic.平衡equilibration6thGroupwww.themegallery.comCom

6、panyLogo6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo洗脫方法?非特異性洗脫:改變緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)或溫度使物質(zhì)構(gòu)象改變，濃縮、洗脫后立即中和稀釋或透析，使蛋白質(zhì)迅速恢復(fù)到天然結(jié)構(gòu)?特異性洗脫：再次利用生物學(xué)特異性只洗脫和配基專一作用的蛋白質(zhì)，不洗脫由于非專一吸附上去的雜蛋白6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo親和層析的基本類型生物親和層析免疫親和層析金屬離子螯合親和層析染料親和層析擬生物

7、親和層析6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo金屬離子螯合親和層析金屬離子螯合親和層析是利用金屬離子的絡(luò)合或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。NiSepharose6FastFlow含His-tag的rhEGF：His的咪唑基可以與Ni2+特異性結(jié)合。6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo6thGroupwww.themegallery.comCompanyLogo常見(jiàn)問(wèn)題1純化的組分中沒(méi)有His標(biāo)簽的蛋白?23樣品黏度太大？層析柱堵塞？6thGroupwww.themegal

8、lery.comCompanyLogo