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1、親和層析法親和層析法的基本介紹操作過(guò)程親和層析法的應(yīng)用主要內(nèi)容制備方法1、生物親和作用生物物質(zhì)具有識(shí)別特定物質(zhì)并與該物質(zhì)的分子相結(jié)合的能力。這種識(shí)別并結(jié)合的能力，能區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相近的其它分子。如蛋白酶與輔酶、抗原和抗體、激素與其受體等體系。由于分離方法的特異性不強(qiáng)，導(dǎo)致分離純化的收得率較低；為了解決這一問(wèn)題，一種有效的分離方法應(yīng)運(yùn)而生——親和層析(AffinityChromatography，AC)，利用被分離的生命大分子物質(zhì)和特異性配體之間能可逆性結(jié)合與解離的原理而建立的層析方法。在親和層析中，作為固定相的一方
2、稱為配基。配基必須偶聯(lián)于不溶性母體上。母體又稱為載體或擔(dān)體，一般采用瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝膠和纖維素等。2、親和作用的機(jī)理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)鑰匙和鎖孔的關(guān)系相互作用力靜電作用、氫鍵、疏水性相互作用、配位鍵、弱共價(jià)鍵等。影響親和作用的因素離子強(qiáng)度、pH值、抑制氫鍵形成的物質(zhì)、溫度、液體離子、螯合劑等。親和層析載體的組成配體以共價(jià)鍵結(jié)合到活化的基質(zhì)上，構(gòu)成固相載體。原理親和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑；當(dāng)含有混合組份的樣品（流動(dòng)相）通過(guò)此固定相時(shí)，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才
3、能被固定相吸附結(jié)合，其它沒(méi)有親和力的無(wú)關(guān)組份就隨流動(dòng)相流出；然后改變流動(dòng)組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來(lái)。3、特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：上樣量大，純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高，被分離物質(zhì)的活性不易喪失。特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子。缺點(diǎn)：每分離一種物質(zhì)都必須找到合適的配體，并將其制備成固相載體，在洗脫中，交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進(jìn)入產(chǎn)品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。成本相對(duì)較昂貴。4、親和層析的分類特異性配體親和層析：配體一般為復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)（如抗體、受體、酶的類似物等）。其特點(diǎn)是吸附
4、特異性強(qiáng)，結(jié)合力大。通用性配體親和層析：配體一般為簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)（如金屬、染料、氨基酸等）。其成本低，具有較高的吸附容量，但分辨率不及前者。5、親和層析的類型根據(jù)配體與生物大分子之間相互作用體系不同，可以把親和層析分為：生物親和層析利用自然界中存在的生物特異性相互作用物質(zhì)對(duì)的親和作用，通常具有高的選擇性，典型的物質(zhì)對(duì)有酶-底物，酶-抑制劑，激素-受體等。免疫親和層析利用抗原抗體中的一方為配體，親和吸附另一方的分離系統(tǒng)。廣泛應(yīng)用于許多以單克隆抗體作為親和配體的典型蛋白質(zhì)純化。用免疫層析柱進(jìn)行各種類型的免疫檢測(cè)被稱為免疫
5、檢測(cè)法，特別適用于檢測(cè)含量低微的樣品。金屬離子親和層析金屬離子親和層析是利用金屬離子的絡(luò)合物或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)，目的蛋白質(zhì)表面暴露的供電子氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合，這是用于蛋白質(zhì)分離純化的根據(jù)。金屬離子如鋅和銅，已發(fā)現(xiàn)能很好地與組氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巰基結(jié)合，含有不同數(shù)量的這些基團(tuán)的蛋白質(zhì)可以通過(guò)金屬離子親和層析得到分離。擬生物親和層析利用部分分子相互作用，模擬生物分子結(jié)構(gòu)或某特定部位，以人工合成的配基為固定相吸附目的蛋白
6、質(zhì)的親和層析。親和層析的基本原理操作過(guò)程親和層析的應(yīng)用主要內(nèi)容制備方法1、載體的選擇一般情況下，需根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物選擇合適的親和配基來(lái)修飾載體，以制備所需的親和吸附介質(zhì)即固定相。作為載體的物質(zhì)應(yīng)具有：①不溶性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，滲透性好；②物理和化學(xué)穩(wěn)定性高，有較高的機(jī)械強(qiáng)度，使用壽命長(zhǎng)；③抗微生物和酶的侵蝕；④最好為粒徑均一的球形粒子；⑤具有親水性，無(wú)非特異性吸附；⑥含有可活化的反應(yīng)基團(tuán)，利于親和配體的固定化。例：瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時(shí)分別稱為2B、4B、6B。Sepharo
7、se4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應(yīng)用最廣。2、配體的選擇一對(duì)可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。如抑制劑、底物、抗體、輔酶等。依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)配體要考慮兩個(gè)重要因素：正確地預(yù)計(jì)被設(shè)計(jì)的配體構(gòu)像正確預(yù)計(jì)配體的親和力優(yōu)良配體須具備的條件：與待純化的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。一般來(lái)說(shuō)，配體對(duì)大分子物質(zhì)的親合力越高，在親和層析時(shí)，分辨率就越好，應(yīng)用價(jià)值就越高；但若配體與待純化物質(zhì)（生物大分子物質(zhì)）之間的親合力太大時(shí)，對(duì)分離純化是不利的。②具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)與待分離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力，而與樣品中其
8、它組分沒(méi)有明顯的親和力，對(duì)其它組分沒(méi)有非特異性吸附作用。③配體要能夠與基質(zhì)穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不易脫落，并且配體與基質(zhì)偶聯(lián)后，對(duì)其結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯改變，尤其是偶聯(lián)過(guò)程不涉及配體中與待分離物質(zhì)有親和力的部分，對(duì)二者的結(jié)合沒(méi)有明顯影響。④配體自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性在實(shí)驗(yàn)中能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時(shí)可能的較劇烈的條件，可以多次重復(fù)使用。根
