最新基因工程菌的發(fā)酵課件PPT.ppt

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1、基因工程菌的發(fā)酵第一節(jié)工程菌的來源和應(yīng)用一、何謂基因工程基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進(jìn)行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA的重組技術(shù)。重組即利用供體生物的遺傳物質(zhì)或人工合成的基因，經(jīng)過體外或離體的限制酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來形成重組DNA分子，然后在將重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該

2、種生物就可以按人類事先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀。除DNA重組技術(shù)外，基因工程還應(yīng)包括基因的表達(dá)技術(shù)，基因的突變技術(shù)，基因的導(dǎo)入技術(shù)等。四、工程菌的應(yīng)用1，基因藥物紅細(xì)胞生成素胰島素干優(yōu)素乙肝疫苗生長(zhǎng)激素粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子2，其它發(fā)酵產(chǎn)品酶制劑氨基酸（蘇氨酸、色氨酸）抗生素第二節(jié)工程菌的培養(yǎng)就生產(chǎn)流程而言，從發(fā)酵到分離、純化目標(biāo)產(chǎn)物，工程菌和常規(guī)微生物并無太多的差異。但工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，以及安全性等問題，使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點(diǎn)。一、安全問題關(guān)于基因工程的社

3、會(huì)問題，必須提到它的潛在危險(xiǎn)性。經(jīng)過重組的菌和質(zhì)粒一旦用于工業(yè)化生產(chǎn)，就不可避免地進(jìn)入自然界。這些菌能間接地危害人體健康，使治療藥物失去效用，污染環(huán)境等。因此，安全問題是極其重要的。1974年，提出了DNA重組實(shí)驗(yàn)具有潛在生物危險(xiǎn)性的問題。后來，制定了有關(guān)DNA重組實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)則，其目的是保證實(shí)驗(yàn)的安全和推動(dòng)重組DNA的研究。這些準(zhǔn)則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)安全度的評(píng)定，采用物理密封(P1~P4)和生物學(xué)密封(B1和B2)兩種方法。物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實(shí)驗(yàn)人員和向外界擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)規(guī)模

4、在20L以下時(shí)，物理密封由密封設(shè)施、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級(jí)，數(shù)字越大，密封水平越高。生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時(shí)用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴(kuò)散。按密封程度分B1和B2級(jí)，B2級(jí)的密封要求最嚴(yán)格。二、工程菌培養(yǎng)的特點(diǎn)工程菌工業(yè)化培養(yǎng)中，產(chǎn)物的產(chǎn)率往往比實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)規(guī)模為低。為提高工程菌體表達(dá)效率，需采取適當(dāng)措施，提高重組DNA在受體細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)及促進(jìn)表達(dá)產(chǎn)物自細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外分泌。工程菌體的原宿主通常是某些

5、培養(yǎng)物質(zhì)(如某種氨基酸或維生素等)的缺陷型，有些基因工程細(xì)胞生產(chǎn)過程亦產(chǎn)生某些抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝物。在培養(yǎng)過程中應(yīng)考慮控制培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分及其濃度，同時(shí)采取措施，消除抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝物，以保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)。三、工程菌的培養(yǎng)工程菌的營(yíng)養(yǎng)控制質(zhì)粒穩(wěn)定性重組質(zhì)粒拷貝數(shù)的控制及表達(dá)效率1，底物濃度的控制在基因工程茵培養(yǎng)過程，至少要遵循PI級(jí)物理防護(hù)的規(guī)定，因此必需進(jìn)行菌體的高密度培養(yǎng)。從生物安全性考慮，培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。2，質(zhì)粒穩(wěn)定性（1）質(zhì)粒不穩(wěn)定的類型分離性不穩(wěn)定：這是由于在細(xì)胞分裂過程中

6、質(zhì)粒缺失分配到子細(xì)胞中而導(dǎo)致整個(gè)質(zhì)粒丟失。結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定：這是由于重組質(zhì)粒DNA發(fā)生缺失、插入或重排引起的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)變化。（2）影響質(zhì)粒穩(wěn)定的因素與質(zhì)粒穩(wěn)定有關(guān)的基因及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)自身對(duì)其穩(wěn)定性的影響宿主對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定的影響質(zhì)粒拷貝數(shù)重組質(zhì)粒的表達(dá)對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響（3）使質(zhì)粒穩(wěn)定的措施組建合適載體選擇適當(dāng)宿主施加選擇壓力抗生素添加法抗生素依賴變異法營(yíng)養(yǎng)缺陷型法控制基因過量表達(dá)控制培養(yǎng)條件（4）質(zhì)粒保持率為考察質(zhì)粒穩(wěn)定性，在此引入質(zhì)粒保持率Fn的概念，F(xiàn)n表示分批培養(yǎng)中細(xì)胞分裂n次后，培養(yǎng)液中基因工程細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值，即假定在分

7、批培養(yǎng)過程中，細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期每次分裂時(shí)，其質(zhì)粒丟失率為P，則Fn為3，表達(dá)效率及質(zhì)?？截悢?shù)控制在工程菌培養(yǎng)過程中，表達(dá)效率與質(zhì)?？截悢?shù)有關(guān)。在質(zhì)粒穩(wěn)定基礎(chǔ)上，應(yīng)盡可能提高細(xì)胞內(nèi)質(zhì)?？截悢?shù)。在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達(dá)到提高拷貝數(shù)目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細(xì)胞負(fù)荷，此時(shí)拷貝數(shù)較低，而比生長(zhǎng)速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質(zhì)?？截悢?shù)增加，目的基因產(chǎn)量提高。第三節(jié)工程菌分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)對(duì)于質(zhì)粒脫落性不穩(wěn)定，細(xì)胞在分裂時(shí)丟失質(zhì)粒的概率為p，則所以對(duì)于底物對(duì)于產(chǎn)物第四節(jié)培養(yǎng)裝置與產(chǎn)物的提取

8、工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的培養(yǎng)方法類似。在進(jìn)行以工業(yè)化為目的的DNA重組實(shí)驗(yàn)，以及為生產(chǎn)異種基因產(chǎn)物而培養(yǎng)重組菌時(shí)，當(dāng)然應(yīng)采用簡(jiǎn)便易行的培養(yǎng)系統(tǒng)?，F(xiàn)在多半使用大腸桿菌為宿主，而在一般的通氣攪拌罐中大腸桿菌能生長(zhǎng)良好。一、培養(yǎng)罐作為基因重組體的培養(yǎng)裝置，與一直沿用的通氣攪拌培養(yǎng)罐要有區(qū)別，即不僅要防止外部