第十三節(jié)基因工程菌的發(fā)酵

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1、第十三章基因工程菌的發(fā)酵近年來，重組DNA技術(shù)(基因工程)已開始由實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)生產(chǎn)，走向?qū)嵱?。它不僅為我們提供了一種極為有效的菌種改良技術(shù)和手段，也為攻克醫(yī)學(xué)上的疑難雜癥——癌、遺傳病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；為農(nóng)業(yè)的第三次革命提供了基礎(chǔ)；為深入探索生命的奧秘提供了有力的手段?，F(xiàn)在由工程菌產(chǎn)生的珍稀藥物，如胰島素、干擾素、人生長激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不僅保證了這些藥物的來源，而且可使成本大大下降。但是從許多研究中發(fā)現(xiàn)，工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產(chǎn)過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，因而工程菌不穩(wěn)定性的解決已日益受到重視并成為基因工程這一高技術(shù)成就轉(zhuǎn)

2、化為生產(chǎn)力的關(guān)鍵之一。第一節(jié)工程菌的來源和應(yīng)用一、何謂基因工程基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進(jìn)行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。基因工程的核心技術(shù)是DNA的重組技術(shù)。重組即利用供體生物的遺傳物質(zhì)或人工合成的基因，經(jīng)過體外或離體的限制酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來形成重組DNA分子，然后在將重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該種生物就可以按人類事先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖表現(xiàn)出另外一

3、種生物的某種性狀。除DNA重組技術(shù)外，基因工程還應(yīng)包括基因的表達(dá)技術(shù)，基因的突變技術(shù)，基因的導(dǎo)入技術(shù)等?；蚬こ桃话惴譃?個(gè)步驟：一是取得符合人們要求的DNA片段，這種DNA片段被稱為“目的基因”；二是將目的基因與質(zhì)?；虿《綝NA連接成重組DNA；三是把重組DNA引入某種細(xì)胞；四是把目的基因能表達(dá)的受體細(xì)胞挑選出來。DNA分子很小，其直徑只有20埃，約相當(dāng)于五百萬分之一厘米，在它們身上進(jìn)行“手術(shù)”是非常困難的，因此基因工程實(shí)際上是一種“超級顯微工程”，對DNA的切割、縫合與轉(zhuǎn)運(yùn)，必須有特殊的工具。要把目的基因從供體DNA長鏈中準(zhǔn)確地剪切下來，可不是一件容易的事。1968年，

4、沃納·阿爾伯博士、丹尼爾·內(nèi)森斯博士和漢密爾·史密斯博士第一次從大腸桿菌中提取出了限制性內(nèi)切酶，它能夠在DNA上尋找特定的“切點(diǎn)”，認(rèn)準(zhǔn)后將DNA分子的雙鏈交錯(cuò)地切斷。人們把這種限制性內(nèi)切酶稱為“分子剪刀”。這種“分子剪刀”可以完整地切下個(gè)別基因。自70年代以來，人們已經(jīng)分離提取了400多種“分子剪刀”。有了形形色色的“分子剪刀”，人們就可以隨心所欲地進(jìn)行DNA分子長鏈的切割了。DNA的分子鏈被切開后，還得縫接起來以完成基因的拼接。1976年，科學(xué)們在5個(gè)實(shí)驗(yàn)室里幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)并提取出一種酶，這種酶可以將兩個(gè)DNA片段連接起來，修復(fù)好DNA鏈的斷裂口。1974年以后，科學(xué)界正

5、式肯定了這一發(fā)現(xiàn)，并把這種酶叫作DNA連接酶。從此，DNA連接酶就成了名符其實(shí)的“縫合”基因的“分子針線”。只要在用同一種“分子剪刀”剪切的兩種DNA碎片中加上“分子針線”，就會把兩種DNA片段重新連接起來。把“拼接”好的DNA分子運(yùn)送到受體細(xì)胞中去，必須尋找一種分子小、能自由進(jìn)出細(xì)胞，而且在裝載了外來的DNA片段后仍能照樣復(fù)制的運(yùn)載體。理想的運(yùn)載體是質(zhì)粒，因?yàn)橘|(zhì)粒能自由進(jìn)出細(xì)菌細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)用“分子剪刀”把它切開，再給它安裝上一段外來的DNA片段后，它依然如故地能自我復(fù)制。有了限制性內(nèi)切酶、連接酶及運(yùn)載體，進(jìn)行基因工程就可以如愿以償了。運(yùn)載體將目的基因運(yùn)到受體細(xì)胞是基因工程的

6、最后一步，目的基因的導(dǎo)入過程是肉眼看不到的。因此，要知道導(dǎo)入是否成功，事先應(yīng)找到特定的標(biāo)志。例如我們用一種經(jīng)過改造的抗四環(huán)素質(zhì)粒PSC100作載體，將一種基因移入自身無抗性的大腸桿菌時(shí)，如果基因移入后大腸桿菌不能被四環(huán)素殺死，就說明轉(zhuǎn)入獲得成功了。二、工程菌的獲得1，確定目的產(chǎn)物。2，找出產(chǎn)該產(chǎn)物的細(xì)胞。3，將細(xì)胞破碎后提純出全部信使RNA。這些信使中包含了該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的合成信息。4，利用基因擴(kuò)增技術(shù)（PCR），找出所需的目的基因。5，將目的基因連接到設(shè)計(jì)好的質(zhì)粒載體，形成了重組DNA分子。6，將重組后DNA分子引入到受體細(xì)胞內(nèi)，然后選擇合適的培養(yǎng)條件使細(xì)胞繁殖

7、。根據(jù)選擇性標(biāo)記，從菌落中篩選出目的基因的重組(工程)菌。三、工程菌應(yīng)具備的條件1，發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的，同時(shí)是分泌型菌株。2，菌株能利用常用的碳源，并可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。3，菌株不是致病株，也不產(chǎn)內(nèi)毒素。4，代謝控制容易進(jìn)行。5，能進(jìn)行適當(dāng)?shù)腄NA重組，并且穩(wěn)定，重組的DNA不易脫落。四、工程菌的應(yīng)用1，基因藥物例如，紅細(xì)胞生成素、胰島素、干優(yōu)素、乙肝疫苗、生長激素和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子等。2，其它發(fā)酵產(chǎn)品例如酶制劑、氨基酸（蘇氨酸、色氨酸）、抗生素等。第二節(jié)工程菌的培養(yǎng)就生產(chǎn)流程而言，從發(fā)酵到