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《酵母轉(zhuǎn)化(陳晗俊)..》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、酵母轉(zhuǎn)化(一)原理：我們采用的是PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母。PEG是一種高分子聚合物,只有分子量達(dá)到3000左右的PEG才會(huì)發(fā)揮最大的轉(zhuǎn)化促進(jìn)作用。本文使用的PEG分子量為3350,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明促轉(zhuǎn)化效果可以達(dá)到103～105cfu/μg。PEG在酵母轉(zhuǎn)化中起到在高濃度醋酸鋰環(huán)境中保護(hù)細(xì)胞膜,減少醋酸鋰對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的過渡損傷,同時(shí)促進(jìn)質(zhì)粒與細(xì)胞膜接觸更緊密。PEG的濃度是務(wù)必適宜,這一點(diǎn)很重要。LiAc可使酵母細(xì)胞產(chǎn)生一種短暫的感受性狀態(tài),此時(shí)它們能夠攝取外源性DNA。鮭魚精擔(dān)體DNA為短的線形
2、單鏈DNA,在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中主要是保護(hù)質(zhì)粒免于被DNA酶降解;另外還可能在酵母細(xì)胞攝取外源性環(huán)形質(zhì)粒DNA中發(fā)揮協(xié)助作用。在每次使用前務(wù)必進(jìn)行熱變性,使可能結(jié)合的雙鏈DNA打開,保證鮭魚精擔(dān)體DNA在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)體系中以單鏈形式存在(二)材料、儀器設(shè)備及試劑：1.SD培養(yǎng)基：lYNB：1.6g/Ll硫酸銨：5g/Ll氨基酸：根據(jù)質(zhì)粒的篩選壓力選擇性添加l調(diào)節(jié)pH=5.8，121°滅菌15min2.YPDA培養(yǎng)基l胰蛋白胨20g/Ll酵母浸膏10g/Ll瓊脂20g/L(固體)l腺嘌呤15ml0.2%腺嘌呤
3、/Ll調(diào)節(jié)pH=7.5，121°滅菌15min3.0.9%NaCl（w/v）lNaCl:0.9glmilipore水定容到100mll滅菌121°，20min4.100%DMSO從試劑瓶中分裝到ep管中，500ul每管，室溫保存5.10×TE（pH=7.5）：（0.1MTris-HCl，10mMEDTA）lTris-HCl1.211g/100mllEDTA0.37g/100mll調(diào)節(jié)pH=7.5,121°，20min6.10×LiAc（pH=7.5）l1MLiAc10.202g/100mll用醋
4、酸調(diào)節(jié)pH=7.5，121°滅菌20min1.1.1×TE/LiAclTris-HCl11ml10×LiAc（pH=7.5）/100mllEDTA11ml10×EDTA（pH=7.5）/100mll調(diào)節(jié)pH=7.5,121°，20min2.50%PEG3350：lPEG3350：50gl已滅菌的milipore水：定容到100ml（可用50°水浴助溶，PEG易吸水，不可滅菌）3.PEG/LiAc：現(xiàn)配現(xiàn)用，在超凈臺(tái)中操作，吸取母液到ep管或50ml離心管中終濃度10mlPEG335040%8ml
5、50%PEG3350TEbuffer1×1ml10×TELiAc1×1ml10×LiAc4.變性的鮭魚精DNA(10mg/ml)5.milipore水，70%酒精棉球，50ml離心管4個(gè)，ep管一盒，15ml試管架，50ml試管架，ep管架(一)具體方法：uA：酵母感受態(tài)制備1.從平板上或保種管中，挑少許酵母，在YPDA平板上劃單克隆，30°培養(yǎng)3天左右。2.從平板上分別挑取單克隆（直徑2-3mm）到含有3mlYPDA的玻璃試管中（平行做3管）3.30°，250rpm，培養(yǎng)8-12h4.取200
6、ul菌液，測(cè)OD6005.選取OD600值最大的一個(gè)試管（即活力最高的一個(gè)），吸取5ul轉(zhuǎn)移至50m新鮮的YPDA培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基裝在250ml三角瓶中）6.30°，230rpm，培養(yǎng)16-20h，直至OD600=0.15-0.37.將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)入2個(gè)50ml離心管，室溫離心3000g，3min，棄上清，用100ml新鮮的YPDA懸起管底的菌體，并倒入干凈的三角瓶中。8.30°，230rpm培養(yǎng)直到OD600=0.4-0.5（3-5小時(shí)）9.將菌液倒入2個(gè)50ml離心管，室溫離心，3000g
7、，3min，棄上清，每個(gè)離心管用30mlmilipore水重懸。10.再次離心，3000g，3min，棄上清，每管用1.4ml1.1×TE/LiAc重懸。11.將重懸的菌液轉(zhuǎn)移到2個(gè)ep管中，12000rpm，15s12.棄上清，每管用600ul1.1×TE/LiAc重懸，將兩管重懸菌液并入一管，準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)化。uB：酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小規(guī)模轉(zhuǎn)化大規(guī)模轉(zhuǎn)化1.加入質(zhì)粒DNA100-500ng3-5ug鮭魚精DNA(變性的，10mg/ml)5ul20ul加入感受態(tài)細(xì)胞,輕彈混勻50ul600ul1.加入P
8、EG/LiAc,輕彈混勻500ul2.5ml2.30°水浴，每10-15min輕彈混勻30min45min3.加入DMSO,輕彈混勻20ul160ul4.42°水浴，每5-10min輕彈混勻15min20min5.離心，棄上清最大轉(zhuǎn)速3000g15s3min6.用液體YPDA培養(yǎng)基重懸1ml3ml7.30°，230rpm，培養(yǎng)90min90min8.離心，棄上清最大轉(zhuǎn)速3000g15s3min9.用0.9%NaCl重懸1ml15ml10.涂板在相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基上。(一)注意事項(xiàng)：1.轉(zhuǎn)化效率與很
