抗體的選擇和保存指南

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1、抗體選擇指南抗體保存指南??抗體說(shuō)明書(shū)樣本??一抗體選擇指南:檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，為縮小抗體的選擇范圍選中合適的抗體，需要考慮如下幾種因素：1.?分析或應(yīng)用的類型2.?樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)3.?樣本的種屬4.?抗體宿主的種類5.?抗體的標(biāo)記和檢測(cè)1分析試驗(yàn)的應(yīng)用類型??一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)適用于何種分析類型，如：可以應(yīng)用于WB?IHC?ICC?ELASA分析等，如果抗體說(shuō)明書(shū)沒(méi)有提及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證，如果抗體不適用某些分析試驗(yàn)，則會(huì)在抗體說(shuō)明書(shū)上標(biāo)

2、注出來(lái)不適于某分析試驗(yàn)。2?樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)?了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，至少兩方面因素需要考慮(1)..待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來(lái)，其中的免疫原包括：全長(zhǎng)蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說(shuō)明書(shū)一般都有免疫原的描述，如果打算檢測(cè)的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長(zhǎng)的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS流式檢測(cè)活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來(lái)免疫制備的抗體。(2)樣本的提取或處理過(guò)程：某些抗體要求樣本經(jīng)過(guò)某些特殊處理，例如：許

3、多抗體只識(shí)別還原和變性的、表位已暴露不受二級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識(shí)別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只識(shí)別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無(wú)需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會(huì)在抗體說(shuō)明書(shū)上應(yīng)用部分標(biāo)示出來(lái)3樣本的物種??應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說(shuō)明書(shū)上的交叉反應(yīng)種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測(cè)驗(yàn)證過(guò)，應(yīng)通過(guò)序列比對(duì)的方法來(lái)預(yù)測(cè)交叉

4、反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy和NCBIBLAST來(lái)進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對(duì)。4一抗宿主物種的選擇??一般說(shuō)來(lái)，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無(wú)偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測(cè)方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對(duì)不含IgG的細(xì)胞裂解物

5、樣本的westernblotting檢測(cè)，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在westernblot檢測(cè)中則結(jié)合出現(xiàn)IgG分子50and25kDa的重鏈和輕鏈條帶。5二抗的選擇??二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來(lái)源，例如：如果你的一抗是小鼠的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗anti-mousesecondary。建議檢查二抗說(shuō)明書(shū)確保該抗體適用于你的檢測(cè)應(yīng)用，二抗一般連接熒光素FITC或發(fā)光團(tuán)。6雙重染色抗體的選擇??用未偶聯(lián)一抗進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物或組織切片的雙重免疫染色要求一抗來(lái)源于不同物種并且二抗分別識(shí)別

6、其中之一，二抗說(shuō)明書(shū)應(yīng)描述其與其它物種來(lái)源的免疫球蛋有否有交叉吸附。7熒光和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記?連接于二抗的標(biāo)記物是為了檢測(cè)抗體的結(jié)合，選擇標(biāo)記物依賴于幾個(gè)參數(shù)：檢測(cè)方法：熒光或著色沉淀，熒光標(biāo)記物用特殊波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)發(fā)射出可見(jiàn)光，下表列出了幾種熒光素的分子特征：熒光素顏色激發(fā)波發(fā)射波長(zhǎng)分子量Aminomethylcoumarin(AMCA)Blue353440410Fluorescein(FITC)Green495528390Fluorescein(DTAF)Green495528530Rhodamine(TRITC)Red550570444TexasRedtm

7、Red596620625Cy2tmGreen489505897Cy3tmOrange552565949Cy3.5tmScarlet5815961,286Cy5tmFar-Red650667975Cy5.5tmNearInfra-Red6787031,312Cy7tmNearInfra-Red7437671,001R-Phycoerythrin(RPE)Red488575240,000B-Phycoerythrin(BPE)Red545575240,000C-PhycocyaninRed618640110,000R-PhycocyaninRed61562011

8、0,000二抗連接標(biāo)記酶HRPandAP與其底物產(chǎn)生