小菜蛾氣味受體和離子型受體的克隆與表達(dá)

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1、萬方數(shù)據(jù)摘要UniversityCode：10225RegisterCode：S14803DissertationfortheDegreeofMasterGeneCloningandExpressionAnalysisofOdorantReceptorsandIonotropicReceptorsintheDiamondbackMoth(Plutellaxylostella)Candidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：Dateof0ralExamination：Univer

2、sity：KONGChang-yiProf．YANShan．chunProf．WANGGui-rongMasterForestProtectionJune，2014NortheastForestryUniversity萬方數(shù)據(jù)摘要lIIIIIIIII11111IIJIIIIIIIIIIIIIIIIIlY2721195昆蟲種群之所以數(shù)量龐大，離不開一個(gè)精準(zhǔn)而敏感、復(fù)雜而特異的嗅覺系統(tǒng)。嗅覺系統(tǒng)，在介導(dǎo)昆蟲行為過程中起主導(dǎo)作用，如日常生活中定位食物、選擇棲息地，又如繁衍后代時(shí)探求配偶、交配產(chǎn)卵，再如趨利避害時(shí)親屬識(shí)別、躲避天敵等等。就是利用這個(gè)靈敏的嗅覺系統(tǒng)，昆蟲精準(zhǔn)的完成了從識(shí)別氣味

3、到作出生理和行為反應(yīng)的整個(gè)過程。重要農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)害蟲小菜蛾體形較小，易躲避敵害、反應(yīng)靈敏、繁殖迅速、大量取食十字花科蔬菜，都離不開其靈敏精準(zhǔn)的嗅覺系統(tǒng)。目前，取代菜青蟲，小菜蛾已成為十字花科蔬菜上第一大害蟲，直接造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。在觸角識(shí)別氣味這一過程中，多個(gè)蛋白參與了嗅覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中氣味受體(odorantreceptor，OR)和離子型受體(ionotropicreceptor，IR)存在于特異性的嗅覺感覺神經(jīng)元反應(yīng)中。為了研究小菜蛾嗅覺識(shí)別的分子機(jī)制，項(xiàng)目組已通過二代DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)小菜蛾成蟲觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了小菜蛾的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，通過對(duì)高質(zhì)量序列的拼接組裝和功能

4、注釋，預(yù)測(cè)出小菜蛾的候選嗅覺基因。重點(diǎn)對(duì)其中的受體基因進(jìn)行了鑒定和序列分析，包括54個(gè)ORs基因和16個(gè)IRS基因。在確定了小菜蛾轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)上，本研究驗(yàn)證了54個(gè)ORs候選基因，16個(gè)IRs候選基因，并對(duì)其進(jìn)行了克隆及表達(dá)，主要研究成果如下：1．在得到的54個(gè)ORs候選基因中，有23個(gè)基因的eDNA是全長(zhǎng)序列，其開放閱讀框(openreadingframe，ORF)長(zhǎng)度為1156．2187bp堿基，編碼163．473個(gè)氨基酸。序列分析結(jié)果顯示這些ORs具有5．8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這符合昆蟲ORs的典型結(jié)構(gòu)特征：長(zhǎng)度在370—440個(gè)氨基酸之間，包括七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，得到IRs候選

5、基因16個(gè)，其中5個(gè)IRs基因?yàn)槿L(zhǎng)序列。其中9個(gè)IRs有三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這也與IRs基因的典型結(jié)構(gòu)特征相吻合。通過半定量PCR技術(shù)對(duì)獲得的小菜蛾的候選ORs和IRs受體基因進(jìn)行驗(yàn)證，并初步分析它們?cè)谛巯x觸角、雌蟲觸角和足中的表達(dá)情況。結(jié)果在觸角中檢測(cè)到了全部54個(gè)ORs和16個(gè)IRs的表達(dá)，證明預(yù)測(cè)結(jié)果的可信性。結(jié)果顯示，54個(gè)ORs基因主要在觸角中表達(dá)。其中，PxylORl、PxylOR3、PxylOR4、PxylOR5、PxylOR6和PxylOR7均是雄蛾觸角中高表達(dá)，這6個(gè)ORs都屬于性信息素受體(pheromonereceptors，PRs)，這與前期工作中項(xiàng)目組其他人

6、員的研究結(jié)果一致。PxylOR8在雌蛾觸角中特異表達(dá)。其余47個(gè)ORS基因中，雌雄均有表達(dá)，在部分基因中雌雄表達(dá)水平略微有高低。對(duì)比于ORS基因，IRs基因的表達(dá)幾乎不存在雌雄差異，是在雌雄觸角中均有表達(dá)。其中PxyllR7d．3和PxyllR76b這兩個(gè)基因表達(dá)水平較低。本實(shí)驗(yàn)中得到IRs基因在雌雄之間的表達(dá)水平相似的結(jié)果，再次驗(yàn)證了IRs不同于ORs。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在斜紋夜蛾(Spodopteralitura)IRs的研究中。因此推測(cè)在IRs相對(duì)高保守的序列和表達(dá)中，可能暗示著IRs具有保守的功能。2．根據(jù)預(yù)測(cè)出的小菜蛾的氣味受體候選基因，克隆得到其中三條普通氣味受體基因萬方

7、數(shù)據(jù)摘要PxylORl6、PxylORl7和PxylORl8(Genbank登錄號(hào)分別為KF717601．KF717603)的全長(zhǎng)序列。PxylORl6開放閱讀框全長(zhǎng)為1218bp，編碼406個(gè)氨基酸；PxylORl7開放閱讀框全長(zhǎng)為1200bp，編碼400個(gè)氨基酸；PxylORl8開放閱讀框全長(zhǎng)為1191bp，編碼397個(gè)氨基酸。通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因沒有聚在已知的PRs一支，屬于普通氣味受體。由于普通氣味受體沒有性信息素受體那么保守，因此篩選得到的三個(gè)基因是