豬圓環(huán)病毒2型與細(xì)胞自噬的相互作用

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1、分類號：S晝55：3密級：公矗單位代碼：!鯉墨互學(xué)號：2Q!Q堡2壘豬圓環(huán)病毒2型與細(xì)胞自噬的相互作用InteractionBetweenPorcineCircovirsType2andAutophagy學(xué)位申請人：李紅園指導(dǎo)教師：宋勤葉教授學(xué)科專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一三年六月一日獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得塑蘭堡壘些盤鱟或

2、其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位敝作者讎多碉簽字日期：例猝朋堋學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解塑蘭堡盔些盤堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)塑韭盛些盤鱟可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名：／毒荔砑導(dǎo)師簽名：緣釤斗簽字日期：卯

3、，≥年多月工日簽字日期：卅J；年每月上日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通訊地址：電話：郵編：摘要豬圓環(huán)病毒2型(porcineeircovirustype2，PCV2)可以引起豬的免疫功能抑制和持續(xù)性感染，其引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)是危害當(dāng)今全球養(yǎng)豬生產(chǎn)的最重要的病毒性傳染病之一，目前關(guān)于PCV2的致病機(jī)制仍然不清楚，因此深入探究PCV2致病機(jī)理十分必要。細(xì)胞白噬(Autophagy)在病原體感染過程中發(fā)揮著重要作用，與病毒的清除和逃避有關(guān)。本論文擬揭示PCV2感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬的現(xiàn)象，分析細(xì)胞自噬在PCV2復(fù)

4、制中的作用，旨在從一個(gè)新視角為深入研究PCV2的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。用PCV2SD／2008株感染或經(jīng)紫外線滅活后刺激PK-15細(xì)胞，運(yùn)用透射電鏡和激光共聚焦免疫熒光技術(shù)，分別檢測細(xì)胞中的自噬囊泡和自噬體標(biāo)志物L(fēng)C3分子以及自噬降解底物p62蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，PCV2活毒及滅活后均能誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞產(chǎn)生大量的雙層膜和單層膜的自噬體樣囊泡，顯著提高自噬體標(biāo)志分子LC3的表達(dá)量，降低自噬底物p62的表達(dá)量。進(jìn)而用PCV2SD／2008株感染5w健康巴馬香豬，感染后3、7、28d，在豬的淋巴結(jié)中的巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大量自

5、噬囊泡，在肺泡巨噬細(xì)胞以及淋巴結(jié)、脾臟、腎臟等組織細(xì)胞內(nèi)可檢測到自噬體標(biāo)志物L(fēng)C3分子表達(dá)。上述體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCV2可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬的發(fā)生。為了明確自噬對PCV2復(fù)制的影響，在PCV2感染PK-15細(xì)胞之前或之后分別應(yīng)用白噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin,Rapa)和自噬抑制劑3．甲基腺嘌呤(3-MA)人工改變宿主細(xì)胞的自噬活性，然后應(yīng)用透射電鏡、激光共聚焦免疫熒光、Real-timePCR及IPMA等技術(shù)檢測細(xì)胞自噬囊泡、自噬標(biāo)志分子或PCV2核酸含量，分析自噬對PCV2復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，利用Rapa誘導(dǎo)

6、細(xì)胞自噬可顯著提高PK-15細(xì)胞內(nèi)PCV2核酸含量(P

7、4只小鼠，取肝臟或脾臟檢測自噬現(xiàn)象與PCV2載量。結(jié)果顯示，感染后7、14d在自噬誘導(dǎo)小鼠的脾臟和肝臟混合物內(nèi)沒有檢NNPCV2核酸，而于感染后21、28d顯著高于自噬抑制組和PCV2單獨(dú)感染組的含量(P<0．01)；自噬誘導(dǎo)小鼠肝臟、脾臟等組織中的病毒蛋白信號數(shù)量的變化趨勢與自噬體標(biāo)志分子LC3和Beclin信號數(shù)量的趨勢基本一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞自噬參與了PCV2的感染過程，并對病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及持續(xù)感染產(chǎn)生影響。綜上所述，本研究證明PCV2感染可誘導(dǎo)細(xì)胞白噬，而細(xì)胞自噬對PCV2的體外復(fù)制有促進(jìn)作用，自噬有利于動(dòng)

8、物機(jī)體對PCV2的清除，但同時(shí)自噬又影響病毒在動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制和持續(xù)感染。關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；細(xì)胞自噬；病毒復(fù)制；雷帕霉素；3．甲基腺嘌呤InteractionBetweenPorcineCircovirsType2andAutophagyAut