葉綠素的定量測(cè)定及葉綠素?zé)晒鈨x分析詳細(xì)

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1、葉綠素的定量測(cè)定及葉綠素?zé)晒鈨x分析實(shí)驗(yàn)原理葉綠素的定量測(cè)定：葉綠素a、b在紅光區(qū)的最大吸收峰分別位于663nm與645nm，又，根據(jù)光密度的加和性我們可以在這兩個(gè)波長(zhǎng)的光下分別測(cè)葉綠素提取液的消光度并根據(jù)其不同情況的比吸收系數(shù)來(lái)計(jì)算葉綠素a、b各自的含量。另外，由于葉綠素a、b在652nm波長(zhǎng)光照下有相同比吸收系數(shù)34.5，故可測(cè)出總?cè)~綠素含量。葉綠素?zé)晒鈨x參數(shù)分析：接受了1個(gè)光子的激發(fā)態(tài)的葉綠素有三種途徑來(lái)回到基態(tài)，分別為熒光、光化學(xué)反應(yīng)和熱。因此測(cè)量葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力參數(shù)可以反映植物光合作用的狀態(tài)（光能的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及分配等）。葉

2、綠素?zé)晒鈨x可分為連續(xù)激發(fā)式與脈沖調(diào)制式，本次試驗(yàn)用的是脈沖調(diào)制式，有便攜的特點(diǎn)。已知植物熒光多來(lái)自PSII天線(xiàn)色素蛋白復(fù)合體中的葉綠素a，熒光發(fā)射波長(zhǎng)范圍約在650-780nm，發(fā)射峰在685nm與735nm。當(dāng)植物經(jīng)過(guò)暗適應(yīng)后，所有的PSII都處于完全打開(kāi)狀態(tài)，即其下游PQ等都處于氧化狀態(tài)，PSII系統(tǒng)可以接受電子。此時(shí)經(jīng)過(guò)激發(fā)光照射后所發(fā)射的熒光是固定熒光F0。之后用飽和脈沖技術(shù)，即用一個(gè)持續(xù)時(shí)間很短的強(qiáng)光關(guān)閉所有光合作用電子門(mén)使PSII的光化學(xué)作用暫時(shí)無(wú)法進(jìn)行，再測(cè)量熒光，可得最大值Fm（此時(shí)光合作用能量全部轉(zhuǎn)化為熒光和熱

3、）。Fv為可變熒光，為Fm與F0之差，反應(yīng)了QA的還原情況。實(shí)驗(yàn)儀器及材料脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x，分光光度計(jì)，研缽，漏斗，分析天平。菠菜葉，80%丙酮，碳酸鈣，石英砂，不同環(huán)境下的煙草。實(shí)驗(yàn)步驟1.葉綠素定量測(cè)定1.稱(chēng)取新鮮菠菜葉片5g剪碎置于研缽中，加入適量碳酸鈣與石英砂和適量丙酮，勻漿，繼續(xù)加入適量丙酮碾磨充分，用丙酮過(guò)濾于帶刻度試管內(nèi)，定容至25ml，搖勻。2.以80%丙酮為參比液，分別在645nm、663nm與652nm波長(zhǎng)光照射下測(cè)量吸光度。3.處理數(shù)據(jù)。2.葉綠素?zé)晒鈨x參數(shù)分析1.選取一盆從溫室移至室內(nèi)條件下的煙草植

4、株與一盆室內(nèi)條件（逆境）處理的煙草植株，分別在相似位置夾上葉片夾子，暗適應(yīng)20min。2.用葉綠素?zé)晒鈨x在Fv/Fm檔測(cè)量葉片熒光參數(shù)。3.數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.原始數(shù)據(jù)記錄1.葉綠素定量測(cè)定表1.稀釋1倍后的提取液OD值測(cè)量波長(zhǎng)（nm）645663652OD0.4081.0070.582表2.稀釋2倍后提取液OD值測(cè)量波長(zhǎng)（nm）645663652OD0.1900.4380.2512.葉綠素?zé)晒鈨x參數(shù)分析表3.熒光參數(shù)第一組參數(shù)F0FmFv/mFv/0正常23912490.8084.225脅迫2789660.7122.474表

5、4.熒光參數(shù)第二組（同組人測(cè)量）參數(shù)F0FmFv/mFv/0正常31615500.7963.905脅迫31711710.7292.6942.數(shù)據(jù)處理及分析1.葉綠素定量測(cè)定由于稀釋一倍時(shí)有測(cè)量數(shù)據(jù)超出量程，故改為稀釋兩倍。已知葉綠素a、b80%丙酮溶液最大吸收峰在663nm下分別為82.04與9.27,645nm下分別為16.75與45.6，可列出關(guān)系式：D663=82.04Ca+9.27bD645=16.75Ca+45.6b代入稀釋兩倍后的數(shù)據(jù)，解得Ca`=5.08mg/l,Cb`=2.31mg/l故原提取液內(nèi)Ca=20.32

6、mg/l,Cb=9.24mg/l。葉綠素總量為CT=29.56mg/l。若用OD652求葉綠素總含量：CT=D652*100034.5由稀釋一倍的數(shù)據(jù)得源提取液葉綠素總濃度CT1=33.7mg/l由稀釋兩倍的數(shù)據(jù)得源提取液葉綠素總濃度CT2=29.1mg/l由CT、CT1和CT2算出的葉綠素含量分別為1.478mg/g、1.685mg/g、1.455mg/g。2.葉綠素?zé)晒鈨x參數(shù)分析F0：在第一組數(shù)據(jù)中，F(xiàn)0正常>F0脅迫且差值為39.而第二組數(shù)據(jù)中F0正常與F0脅迫相差不大，有F0脅迫—F0正常=1。F0為基礎(chǔ)熒光，是在所有P

7、SII都處于打開(kāi)狀態(tài)時(shí)，即都可以發(fā)生光反應(yīng)時(shí)，收到適當(dāng)激發(fā)光后發(fā)出的熒光。是一個(gè)與葉綠素濃度有關(guān)的基礎(chǔ)量。因此可能與是否受短期脅迫關(guān)系不大，而與葉片本身生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)。Fm：受脅迫的Fm值明顯小于不受脅迫的Fm值。Fm1正常-Fm1脅迫=283，F(xiàn)m2正常-Fm2脅迫=379。FFm為所有PSII關(guān)閉時(shí)所測(cè)熒光，即此情況下PSII將本來(lái)要轉(zhuǎn)化為傳遞電子的能量都作為熒光與熱散發(fā)出。因此Fm可用來(lái)大致表示葉片接收的光能。Fv、Fv/m、Fv/0：Fv=Fm-F0，表示可變熒光，是在排除了固定熒光后所剩的光能，即可能用于光化學(xué)反應(yīng)的最大

8、能量。Fv可以反映葉綠素的活性。由數(shù)據(jù)知脅迫條件下Fv明顯減小，可知在脅迫狀態(tài)中光合作用系統(tǒng)受阻。Fv/m是PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，可反映PSII反應(yīng)中心的最大光能轉(zhuǎn)換效率。分析數(shù)據(jù)知Fv/m正常都稍稍大于Fv/m脅迫，即正常植株的PSII最大前光能轉(zhuǎn)換率稍