人丙酮酸激酶( pk)酶聯(lián)免疫分析試劑盒 使用說明書

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1、人丙酮酸激酶（PK）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供體外研究使用!預(yù)期應(yīng)用ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中丙酮酸激酶（PK）含量。實(shí)驗(yàn)原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗PK抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗PK抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的PK呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1.酶聯(lián)板：一塊（96孔）2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2

2、瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200U/L，做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋）后，分別稀釋為200U/L，100U/L，50U/L，25U/L，12.5U/L，6.25U/L，3.12U/L，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0U/L，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制50U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml（不要少于0.3ml）100U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。3.樣品稀釋液：1×20ml。4.檢測稀釋液A：1×10ml。5.檢測稀

3、釋液B：1×10ml。6.檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100μl/孔），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。7.檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。8.底物溶液：1×10ml/瓶。9.濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。10.終止液：1×10ml/瓶（2NH2SO4）。11.覆膜：5張12.使用說明書

4、：1份自備物品1.酶標(biāo)儀（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）2.微量加液器及吸頭，EP管3.蒸餾水或去離子水，全新濾紙標(biāo)本的采集及保存1.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000xg離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C1000xg離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000xg離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：以上標(biāo)本置

5、4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過1個月，-80℃不應(yīng)超過2個月；標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。操作步驟實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕

6、輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。6.依序每

7、孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)行檢測。注：1.試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。2.加樣：加樣或加試劑時，請