創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)方法

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1、申報(bào)近海水域創(chuàng)傷弧菌檢出率調(diào)查的檢測(cè)方法確定1.概述創(chuàng)傷弧菌是一種可能致命的病原菌,深入了解水體、海產(chǎn)品等各種環(huán)境中創(chuàng)傷弧菌的生態(tài)學(xué),將有助于降低消費(fèi)者感染創(chuàng)傷弧菌的風(fēng)險(xiǎn)。目前創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)分離鑒定方法、免疫學(xué)及基因檢測(cè)方法[1],介于當(dāng)前本中心的實(shí)驗(yàn)條件,適宜采用傳統(tǒng)分離鑒定方法。以下對(duì)該方法進(jìn)行表述。2.傳統(tǒng)分離鑒定方法2.1儀器與試劑2.1.1創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株創(chuàng)傷弧菌屬于危害程度第三類病原微生物[2],本實(shí)驗(yàn)室已配備生物安全柜,具有BSL-2實(shí)驗(yàn)室水平,滿足第三類病原微生物的操作要求。在準(zhǔn)備階段,需購

2、買創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC27562)進(jìn)行方法確認(rèn)。2.1.2選擇性培養(yǎng)基選擇性原理:①以纖維二糖為碳源,創(chuàng)傷弧菌利用纖維二糖后產(chǎn)生黃色菌落,便于與其他菌落區(qū)分。②添加了抗生素,所添加的抗生素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抑制作用較小,而對(duì)其他大多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用。③培養(yǎng)溫度高,在較高溫度條件下,創(chuàng)傷弧菌能正常生長(zhǎng),而其他大多數(shù)細(xì)菌在這個(gè)溫度下生長(zhǎng)受到抑制或根本就不能存活。在環(huán)境分離中分離創(chuàng)傷弧菌時(shí),最好是先用CC瓊脂培養(yǎng)基、VVM培養(yǎng)基或VVMc培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),在獲得創(chuàng)傷弧菌菌株后,再用CPC瓊脂培養(yǎng)基或mCPC瓊脂培

3、養(yǎng)基進(jìn)行純化,這樣可以再較短的時(shí)間內(nèi)獲得創(chuàng)傷弧菌純化菌株[3]。此外在海產(chǎn)品檢測(cè)中,用TCBS進(jìn)行分離也是一種有效的常規(guī)方法。2.2檢測(cè)方法2.2.1樣品采集擬與寧??h海洋漁業(yè)局合作,對(duì)近海水產(chǎn)品和海水按區(qū)域進(jìn)行樣品采集,其中近海水產(chǎn)品主要為貝殼類養(yǎng)殖水產(chǎn)品。海水采集按季節(jié)(氣候條件)分區(qū)域按《海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)規(guī)范》操作;海產(chǎn)品根據(jù)海水采集點(diǎn)分別就近采集,以獲取其關(guān)聯(lián)性信息。計(jì)劃采集樣品200份。2.2.2分離鑒定2.2.2.1海水樣品水樣處理:采集的海水樣品搖勻后量取100mL,加入無菌Tween80至終濃度為5×10-

4、6g/mL,振蕩20~30min成懸浮液,用無菌生理鹽水按10倍濃度梯度系列振蕩稀釋[4]。分離鑒定:采用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布,選擇3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度,每個(gè)稀釋度涂布2個(gè)平板,于36℃進(jìn)行培養(yǎng)2-5d。對(duì)平板上生長(zhǎng)的可疑菌落進(jìn)行生化鑒定。2.2.2.2海產(chǎn)品海產(chǎn)品處理:稱取5g可食部分樣品加入200mL堿性蛋白胨進(jìn)行無菌均質(zhì),置于30℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。取培養(yǎng)物進(jìn)行10倍梯度稀釋,選擇3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度劃線選擇性平板,每個(gè)稀釋度涂布2個(gè)平板,于36℃進(jìn)行培養(yǎng)2-5d。對(duì)平板上生長(zhǎng)的可疑菌落進(jìn)行生化鑒定。2.2

5、.3分析方法2.2.3.1按檢測(cè)時(shí)間整理數(shù)據(jù),分析創(chuàng)傷弧菌檢出率與季節(jié)(氣候、溫度等條件)的關(guān)系。2.2.3.2按抽樣地點(diǎn)整理數(shù)據(jù),分析創(chuàng)傷弧菌檢出率與地理環(huán)境的關(guān)系。2.2.3.3比對(duì)同一區(qū)域內(nèi),海水創(chuàng)傷弧菌檢出率與海產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌檢出率的關(guān)系。參考文獻(xiàn)[1]陳艷,付萍.創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2008,35(2):91-96.[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.人間傳染的病原微生物名錄.中華人民共和國衛(wèi)生部制定,二○○六年一月十一日.[3]張新中,文萬僥,徐先棟,等.創(chuàng)傷弧菌(Vibriovul

6、nificus)五種選擇性培養(yǎng)基的比較分析[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息,2007,22(10):15-17.[4]張新中,謝珍玉,王世峰,等.海南萬寧小海近岸表層海水弧菌組成及其變化[J].海洋學(xué)報(bào),2011,33(6):142-149.

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