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1、負(fù)載hTERT復(fù)制缺陷型腺病毒的包裝及鑒定陳陵，向國(guó)春，李向紅，蔡永國(guó)，李晶晶，房殿春，羅元輝，李志宏，楊仕明【關(guān)鍵詞】腺病毒表達(dá)載體PackageandidentificationofreplicationdeficientrebinantadenovirusexpressionvectorofhTERT 【Abstract】AIM:ToconstructareplicationdeficientrebinantadenovirusexpressionvectorofhTERT(AdhTERT).METHO
2、DS:ThehTERTgeneofCMVpromoteroftheadenoviralshuttleplasmidpDC315insensedirectionandtheresultantrebinantplasmidpDC315hTERTidpBHGlox(deltaE1,3)containingadenoviralgenome.TheadenovirusexpressionvectoricroscopicobservationandPCRcoamplification.RESULTS:Afterpurifi
3、cationandconcintration,thetiterofAdhTERTreached5×1012pfu/L.VirusparticlescouldbefoundinHEK293cellsundertransmissionelectronmicroscope.BothadenovirusandhTERTspecialfragmentscouldbeamplifiedfromAdhTERTbyPCR,entcouldnotbeamplifiedfromthecontrol.CONCLUSION:There
4、plicationdeficientrebinantadenovirusexpressionvectorofhTERTissuccessfullyconstructed. 【Keyantelomerasereversetranscriptase;adenovirusexpressionvector 【摘要】目的:構(gòu)建負(fù)載人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的復(fù)制缺陷型腺病毒.方法:將克隆有正義hTERTcDNA的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315hTERT與腺病毒包裝質(zhì)粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共轉(zhuǎn)染人
5、胚腎293細(xì)胞(HEK293),包裝負(fù)載hTERT基因的復(fù)制缺陷型腺病毒表達(dá)載體（AdhTERT）.對(duì)AdhTERT擴(kuò)增、純化并濃縮后，進(jìn)一步行感染性鑒定、電鏡鑒定及雙引物PCR鑒定.結(jié)果:純化濃縮后的AdhTERT滴度可達(dá)5×1012pfu/L.電鏡下可見(jiàn)在HEK293細(xì)胞中形成的病毒顆粒，PCR雙引物鑒定AdhTERT可擴(kuò)增出Ad及hTERT特異片段，而對(duì)照則不能擴(kuò)出hTERT片段.結(jié)論:成功構(gòu)建了負(fù)載hTERT基因的復(fù)制缺陷型腺病毒. 【關(guān)鍵詞】人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；腺病毒表達(dá)載體 0引言 人端粒酶逆轉(zhuǎn)
6、錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)Mr127000，包含1132個(gè)氨基酸，其基因位于5號(hào)染色體短臂的最末端（5p15.33），在90%以上的人類腫瘤中高表達(dá)，而正常成熟組織中則基本沒(méi)有表達(dá)〔1〕，因而hTERT是一很有前景的廣譜、特異的抗腫瘤治療靶點(diǎn).腺病毒載體系統(tǒng)具有宿主范圍廣、感染率高、包裝容量大、繁殖滴度高、不發(fā)生整合及安全性好、性質(zhì)穩(wěn)定、載體制備較容易等特點(diǎn),目前已成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后被廣泛應(yīng)用的載體系統(tǒng)〔2〕，可用作hTERT的異位表達(dá)工具.我
7、們通過(guò)構(gòu)建hTERT腺病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究以hTERT為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療奠定基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料 負(fù)載hTERT基因的正義復(fù)制缺陷型腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315shTERT由本室構(gòu)建保存〔3〕；腺病毒包裝質(zhì)粒pBHGloxDeltaE1,3Cre和轉(zhuǎn)化有腺病毒E1區(qū)基因的包裝細(xì)胞HEK293均由第三軍醫(yī)大學(xué)全軍免疫學(xué)研究所鄒強(qiáng)博士惠贈(zèng);大腸桿菌DH5α由本室保存.HindⅢ,BamHI,TaqDNA聚合酶、dNTP,PlasmidPurificationKit(Promega公司);DG
8、L2000DNAMarker(北京鼎國(guó)試劑公司);質(zhì)粒DNA小量快速抽提kit(Omega公司)；脂質(zhì)體DOTAP(Roche公司)；高糖DMEM(Gibco公司);胎牛血清(HyClone公司);酵母提取物及胰蛋白胨(上海生物工程公司);低溶點(diǎn)瓊脂糖(西班牙進(jìn)口分裝);氨芐青霉素(華北制藥廠).hTERT的PCR引物(144bp)為P1：5＇CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA3
