脂多糖對(duì)大鼠下丘腦室旁核gababr1陽性神經(jīng)元的激活作用

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1、脂多糖對(duì)大鼠下丘腦室旁核GABABR1陽性神經(jīng)元的激活作用【關(guān)鍵詞】脂多糖類基因Fosγ氨基丁酸B受體亞單位1(GABABR1)熒光抗體技術(shù)下丘腦室旁核(PVN)應(yīng)激0引言脂多糖(LPS)進(jìn)入機(jī)體能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)激反應(yīng)，動(dòng)物注射LPS是研究免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)之間關(guān)系的常用模型［1］.γ氨基丁酸（GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過離子型受體GABAAR和代謝型受體GABABR發(fā)揮作用［2-3］.GABABR包括GABABR1和GABABR2兩個(gè)亞型，其中GAB

2、ABR1是受體的主要部分［2］.下丘腦是人體神經(jīng)內(nèi)分泌及自主神經(jīng)系統(tǒng)的整合中樞，室旁核（PVN）是下丘腦內(nèi)的重要核團(tuán)，它通過下丘腦垂體腎上腺軸等途徑參與各種應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)［4］.以往的研究［5-6］表明，在下丘腦PVN內(nèi)有表達(dá)GABABR1的神經(jīng)元.另一方面，LPS刺激可引起PVN神經(jīng)元表達(dá)Fos［7-8］，說明PVN神經(jīng)元參與由LPS激發(fā)的免疫應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié),但LPS是否激活PVN內(nèi)GABABR1陽性神經(jīng)元尚缺乏直接的證據(jù)，我們對(duì)此進(jìn)行研究以闡明GABA及其受體在下丘腦對(duì)免疫應(yīng)激反應(yīng)的影響.1材料和方法1

3、.1材料健康成年SD雄性大鼠12只,體質(zhì)量200～250g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.兔抗Fos抗體(Sigma公司)；豚鼠抗GABABR1抗體,得克薩斯紅結(jié)合的羊抗兔IgG,異硫氰酸熒光素（FITC）結(jié)合的驢抗豚鼠IgG(Chemicon公司)；Leica1800恒冷箱切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）；FV1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）.1.2方法1.2.1動(dòng)物模型的建立及切片制備動(dòng)物購入后置于安靜、溫暖(25℃左右)、避強(qiáng)光和自由攝食的環(huán)境中飼養(yǎng)48h，避免非特異性應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生.將動(dòng)物隨機(jī)

4、分為實(shí)驗(yàn)組（6只）和對(duì)照組（6只）.于8∶00點(diǎn)在大鼠清醒狀態(tài)下,對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠迅速腹腔注射300μL生理鹽水溶解的LPS，250g/kg；對(duì)照組注射等劑量的生理鹽水.兩組動(dòng)物在上述相同環(huán)境中放置3h后，用過量10g/L戊巴比妥鈉(>40mg/kg)深度麻醉，迅速開胸經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管，先以100mL生理鹽水洗去血液，繼用含40g/L多聚甲醛的0.1mol/LPBS（pH7.4，4℃)先快后慢灌流固定，取出全腦置于相同的灌注液中后固定4～6h，然后將材料移至含300g/L蔗糖的PB內(nèi)，4℃保存直至組織沉

5、底.恒冷箱切片機(jī)切制含PVN［9］的間腦連續(xù)冠狀切片，片厚30m，切片共分5套，分別用于Fos，GABABR1單標(biāo)記和雙標(biāo)記以及對(duì)照，另一套做備用.切片收集于盛有0.01mol/LPBS的網(wǎng)格內(nèi)，PBS洗3次×10min，待用.1.2.2免疫熒光雙標(biāo)記染色將兔抗Fos抗體(1∶500)和豚鼠抗GABABR1抗體(1∶1000)用含10g/L小牛血清白蛋白和1g/LTritonX100的0.01mol/LPBS混合后常溫孵育切片24h，用0.01mol/LPBS洗3次×10min,然后用得克薩斯紅交聯(lián)的羊抗兔I

6、gG(1∶500)和FITC交聯(lián)的驢抗豚鼠IgG(1∶500)混合液常溫孵育切片2h，用0.01mol/LPBS洗3次×10min,將組織切片貼于載玻片上,自然涼干,用含500g/L甘油的0.01mol/LPBS封片.單標(biāo)記過程同上，抗體用相應(yīng)的組套.在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像.1.2.3對(duì)照實(shí)驗(yàn)除一抗用正常的血清白蛋白代替外，其他程序與上述過程相同，正常血清孵育的組織片上檢測(cè)不到Fos和GABABR1免疫陽性神經(jīng)元.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：每只大鼠在含PVN前、中、后平面上各選取3張切片，計(jì)數(shù)單標(biāo)記和雙標(biāo)記的神經(jīng)

7、元數(shù)量,取每組6只的平均值.結(jié)果以x±s表示,用SPSS13.0對(duì)組間差別進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)意義.2結(jié)果2.1GABABR1在下丘腦室旁核的標(biāo)記GABABR1陽性產(chǎn)物見于神經(jīng)元胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，標(biāo)記的神經(jīng)元發(fā)出明亮的綠色熒光，細(xì)胞輪廓清楚，胞核未染，細(xì)胞形態(tài)多呈圓形，突起不明顯（圖1A,B）.陽性神經(jīng)元較多地分布在下丘腦PVN外側(cè)大細(xì)胞部，并向內(nèi)延續(xù)到小細(xì)胞部及腹側(cè)部，但數(shù)量逐漸減少、染色強(qiáng)度逐漸減弱.雖然LPS組的GABABR1陽性神經(jīng)元數(shù)較對(duì)照組稍多、有些神經(jīng)元染色較重，但兩組之間的差異無

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）.2.2Fos在下丘腦室旁核的標(biāo)記Fos陽性神經(jīng)元發(fā)出明亮的紅色熒光，陽性產(chǎn)物限于胞核內(nèi)，胞核深染、圓形，邊緣光滑，胞質(zhì)未染色，因而樹突、胞體未顯示.對(duì)照組大鼠Fos僅有零星散在分布（圖1C）.LPS組Fos陽性神經(jīng)元主要見于下丘腦PVN內(nèi)側(cè)小細(xì)胞部和腹側(cè)部，在外側(cè)大細(xì)胞部也有少量分布（圖1D）；LPS實(shí)驗(yàn)組的Fos陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，常是對(duì)照組的數(shù)倍，兩組比較差