星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)魚藤酮染毒神經(jīng)元的保護(hù)作用論文

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1、星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)魚藤酮染毒神經(jīng)元的保護(hù)作用論文劉輝尹芳秋許崇亮劉杰徐冬梅【摘要】目的觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液(ACM)對(duì)魚藤酮染毒嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)的神經(jīng)保護(hù)作用。方法將新生SD大鼠中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞分離、純化并培養(yǎng)至第三代后，收集星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液加入到魚藤酮染毒PC12細(xì)胞中，觀察其對(duì)染毒神經(jīng)元形態(tài)、活力及其合成與釋放一氧化氮(NO)、乳酸脫氫酶(LDH)和胞膜ATP酶(ATPase)的影響。結(jié)果20%ACM可明顯改善染毒神經(jīng)元的形態(tài)和活力；與對(duì)照組比較，20%ACM還有效減少了染毒神經(jīng)元NO、LDH的

2、合成和釋放，保護(hù)和提高了ATPase活性。結(jié)論ACM明顯促進(jìn)魚藤酮染毒PC12細(xì)胞的活力，其機(jī)制可能與減少NO、LDH合成釋放及保護(hù)細(xì)胞膜ATPase的活性有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液；魚藤酮；PC12細(xì)胞；保護(hù)目前除發(fā)現(xiàn)部分家族性帕金森病(PD)與相關(guān)基因突變有關(guān)外，約90%的散發(fā)性PD與環(huán)境因素誘發(fā)密切相關(guān)〔1〕。其中，長期接觸殺蟲劑或除草劑與PD發(fā)病似有很強(qiáng)的相關(guān)性〔2〕。魚藤酮(rotenone.freeledium，ACM)中含有神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等多種神經(jīng)營養(yǎng)成分〔4〕。本研究應(yīng)用ACM培

3、養(yǎng)正常及魚藤酮染毒嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)，觀察染毒神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變和活力，以初步探討Ast在魚藤酮神經(jīng)毒理機(jī)制中的作用。1材料與方法1.1主要試劑和儀器魚藤酮(純度97.6%)、四甲基偶氮唑(MTT)購自Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司，兔抗人GFAP多克隆抗體購自北京中杉公司，NO測定試劑盒購自碧云天生物公司，乳酸脫氫酶(LDH)、超微量ATP酶測定試劑盒由南京建成生物公司提供；酶標(biāo)儀購自BIORAD公司，熒光顯微鏡E600為日本尼康產(chǎn)品。1.2Ast培養(yǎng)及ACM收集取生后3dSD新生大鼠，斷

4、頭取中腦組織，按照McCarthy〔5〕所述方法分離和純化Ast，經(jīng)3次傳代后常規(guī)免疫組化GFAP染色鑒定。用于收集ACM的細(xì)胞按1.0×105個(gè)/cm2密度接種在培養(yǎng)瓶中，收集前兩天換入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，收集的無血清ACM經(jīng)離心后轉(zhuǎn)入無菌玻璃瓶中，-20℃凍存待用。1.3PC12細(xì)胞魚藤酮染毒模型的建立PC12細(xì)胞以1×105個(gè)/ml接種于50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種后，每2～3d換液一次。培養(yǎng)的PC12細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長期加入魚藤酮工作液處理，使其終濃度分別為

5、0.0、0.1、0.5、1.0μmol/L。1.4ACM對(duì)染毒PC12細(xì)胞活力的影響為摸索ACM促進(jìn)PC12細(xì)胞活力的合適濃度，將正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞分為5組：完全培養(yǎng)基組；10%ACM組(培養(yǎng)液中含10%ACM,90%完全培養(yǎng)基,余類同)；20%ACM組；50%ACM組；70%ACM組。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48h后,應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞活力。此預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20%ACM在染毒24、48h時(shí)對(duì)PC12細(xì)胞活力的促進(jìn)作用最為明顯，故選用20%ACM來檢測ACM對(duì)染毒PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。PC12細(xì)胞接種于96孔板中，隨機(jī)分成

6、正常對(duì)照組、0.1μmol/L魚藤酮組、0.5μmol/L魚藤酮組和1.0μmol/L魚藤酮組，各實(shí)驗(yàn)組分別用完全培養(yǎng)基和20%ACM進(jìn)行處理，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48h后,應(yīng)用MTT法檢測兩種不同培養(yǎng)基中PC12細(xì)胞活力。1.5ACM對(duì)染毒PC12細(xì)胞合成釋放NO、LDH和ATP酶的影響PC12細(xì)胞培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中，干預(yù)和分組同上。在上述各時(shí)間點(diǎn)收集各實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞培養(yǎng)液置入無菌EP管，分別檢測NO和LDH含量。同時(shí),將各時(shí)間點(diǎn)上每孔的細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化,離心,棄上清,留下層細(xì)胞,每管加入0.3ml生理鹽水制成細(xì)胞懸液后

7、,用超聲波發(fā)生器處理30s使細(xì)胞破碎，檢測細(xì)胞裂解液中LDH含量和超微量ATP酶活性。LDH釋放比=細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量/(細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量+細(xì)胞裂解液中LDH含量)。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS11.0軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1Ast的培養(yǎng)、純化和鑒定分離培養(yǎng)并純化的Ast為扁平梭形或星形，有細(xì)長突起，胞漿豐富，胞核較大，境界清楚，有1～2個(gè)核仁，位于核中央，見圖1。GFAP免疫組化染色證實(shí)培養(yǎng)至第三代的Ast純度可達(dá)95%以上，見圖2。2.2ACM對(duì)染毒PC12細(xì)胞形態(tài)的影響與正常PC1

8、2細(xì)胞比較，0.5μmol/L魚藤酮染毒12h后，PC12細(xì)胞胞體開始變圓，腫脹，胞內(nèi)變性顆粒增多；染毒24h后，細(xì)胞突起減少，核質(zhì)界限不清，部分細(xì)胞膜已不完整，甚至出現(xiàn)細(xì)胞破裂死亡；染毒48h時(shí)，損傷繼續(xù)加重，大部分細(xì)胞胞體變圓或碎裂，細(xì)胞脫壁死亡。經(jīng)20%ACM作用的染毒