外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離

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1、實(shí)驗(yàn)二十四外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離?(Separationofmononuclearcellinperipheralblood)???免疫細(xì)胞是一組不均一的細(xì)胞群體，它包括T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及粒細(xì)胞等，這些細(xì)胞的生物學(xué)特性，如細(xì)胞的大小、密度、表面電荷、黏附能力以及細(xì)胞表面的分子標(biāo)志等均存在差異，借助這些差異可區(qū)分不同的細(xì)胞類(lèi)別。外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離主要有兩種方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分離法和聚乙烯吡咯烷酮硅膠(Percoll)分離法。此處只介紹聚蔗糖

2、-泛影葡胺分離法。【實(shí)驗(yàn)原理】血液中單個(gè)核細(xì)胞的分離常采用密度梯度離心法。市售淋巴細(xì)胞分離液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque)按一定比例混合制成，20℃密度為1.077±0.001，單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其密度為1.050～1.077，而粒細(xì)胞和紅細(xì)胞的密度為1.080～1.110。將待分離的細(xì)胞懸液小心鋪于淋巴細(xì)胞分離液上，經(jīng)離心后單個(gè)核細(xì)胞懸浮于分離液上層界面，而紅細(xì)胞與粒細(xì)胞沉于管底。【主要試劑和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分層液?密度為1.077±0.001。2.5g/L臺(tái)盼藍(lán)。3.

3、250U/ml肝素溶液?用Hank,s液配制。4.Hank,s液。5.注射器、刻度離心管、吸管、滴管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、載玻片、蓋玻片。6.水平離心機(jī)、顯微鏡?！静僮鞣椒ā?.抽取靜脈血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的無(wú)菌試管中搖勻，作白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)。再加入等量Hank,s液混勻。2.取2ml分層液置于離心管中，將稀釋血液沿管壁緩緩疊加于分層液上，形成清晰界面。稀釋血液與分層液的容積比例以2∶1～3∶1為宜。3.置水平離心機(jī)中，2000r/min離心20min。4.離心后從離心管的底部到液面分為四層，依次為紅細(xì)胞和

4、粒細(xì)胞層、分層液層、單個(gè)核細(xì)胞層、血漿層(含血小板和破碎細(xì)胞)。5.用滴管直接吸出單個(gè)核細(xì)胞層，或吸去血漿層后再吸了該層，置于另一離心管中。6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混勻，1000r／min離心l0min。離心后傾棄上清液，再用Hank,s液洗2次。7.用含10%～20%滅活小牛血清的Hank,s液或培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)，并分別計(jì)數(shù)粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞數(shù)，同時(shí)用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力，最后按實(shí)驗(yàn)要求將細(xì)胞懸液調(diào)整到適當(dāng)濃度?！窘Y(jié)果判斷】【注意事項(xiàng)】1.將血液進(jìn)行稀釋可降低血液黏稠度和紅細(xì)胞的聚集，提高單個(gè)核細(xì)

5、胞的收獲量。2.溫度變化可直接影響分層液的密度，即影響細(xì)胞的收獲率和純度。故應(yīng)在室溫(18～25℃)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分層液使用前應(yīng)預(yù)溫至室溫。溫度過(guò)低，淋巴細(xì)胞丟失增多；溫度過(guò)高，會(huì)影響淋巴細(xì)胞活性。3.分離時(shí)的轉(zhuǎn)速與時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同樣品作相應(yīng)調(diào)整。離心速度在2000～2500r/min，離心時(shí)間為l5～20min，離心后若見(jiàn)白霧狀細(xì)胞層中仍摻雜紅細(xì)胞，應(yīng)提高轉(zhuǎn)速或延長(zhǎng)離心時(shí)間，若淋巴細(xì)胞丟失過(guò)多，則應(yīng)適當(dāng)降低轉(zhuǎn)速或離心時(shí)間。4.分層液應(yīng)直接加入管底，防止浸沾四周管壁。5.將細(xì)胞懸液疊加于分層液上時(shí)務(wù)必小心，不要擾亂界面以影響

6、分離效果。6.充分冼滌分離后的單核細(xì)胞，可除去大部分混雜的血小板。【應(yīng)用與評(píng)價(jià)】本方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定。細(xì)胞回收率達(dá)80%～90%，單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95%，淋巴細(xì)胞約占90%～95%，細(xì)胞活力可達(dá)95%以上。但其中仍可混雜少量(約10%)其它細(xì)胞。該方法是目前最理想、最常用分離淋巴細(xì)胞的手段，其制備的細(xì)胞(主要是淋巴細(xì)胞)懸液已能滿足許多細(xì)胞免疫試驗(yàn)要求，也可用于進(jìn)一步制備T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞。故在細(xì)胞免疫試驗(yàn)中有廣泛應(yīng)用，是細(xì)胞免疫檢測(cè)中最基本的技術(shù)之一?！舅伎碱}】1.為何常用密度為1.077土0.001的分層液分

7、離人單個(gè)核細(xì)胞？2.利用密度梯度離心法分離人單個(gè)細(xì)胞，為何要將血液樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)⒁B加于分層液上？外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離—密度梯度離心法一、原理根據(jù)物理學(xué)中顆粒沉降原理，不同密度的物質(zhì)顆粒在其沉降運(yùn)動(dòng)中可因其比重的差別而處于不同的分布位置。利用此原理可設(shè)計(jì)一定比重的液體界面，將外周血中各種不同比重的細(xì)胞通過(guò)離心沉降而達(dá)到使其彼此分離的目的。已知人類(lèi)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重大約在1.075~1.090之間，而紅細(xì)胞與粒細(xì)胞的比重均大于1.090。因此，若用比重為1.077±0.001的分離液則可通過(guò)密度梯度離心方法，

8、在分離液界面上收集外周血單個(gè)核細(xì)胞。?二、器材與試劑器材：（1）水平式離心機(jī)（2）顯微鏡（3）血球計(jì)數(shù)板、血蓋片（4）載玻片、蓋玻片（5）定量移液器、洗耳球（6）刻度離心管（7）試管、滴管、橡皮滴頭（8）小濾紙、擦鏡紙?試劑：（1）抗凝全血（臨時(shí)抽?。?、40倍稀釋的全血（計(jì)數(shù)用）（2）淋巴細(xì)胞分離液（市售，比重：1.