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《多藥耐藥基因-腺病毒重組表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、多藥耐藥基因-腺病毒重組表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定【摘要】目的構(gòu)建多藥耐藥（multidrugresistance，MDR）基因-腺病毒重組表達(dá)載體。方法將MDR1基因插入到腺病毒載體，用磷酸鈣沉淀法將此重組載體轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞，制備重組病毒懸液并感染靶細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果構(gòu)建的MDR1-腺病毒載體在293細(xì)胞中大量產(chǎn)生，病毒滴度達(dá)109PFU/ml，此病毒感染靶細(xì)胞后，在靶細(xì)胞中有MDR1基因的表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建了MDR1-腺病毒重組表達(dá)載體?！娟P(guān)鍵詞】多藥耐藥基因；腺病毒載體；轉(zhuǎn)染Constructionandidenti
2、ficationofmulti-drugresistancegene-adenovirusrecombinantexpressionvectorLIUYu-xia,CHENJun,YUHong．JilinProvincialInstituteofCancerResearch,Changchun130012,China【Abstract】ObjectiveConstructionofmulti-drugresistancegene(MDR)-adenoviralrecombinantexpressionvector．M
3、ethodsMDR1genewillbeinsertedintotheadenovirusvector，bycalciumphosphateprecipitationmethodtherecombinantplasmidtransfectinto293cells．Recombinantvirus8suspensionismadeandinfecedtargetcellsandtoindentify．ResultsConstructedMDR1-adenovirusvectorproducesalargenumberi
4、n293cells，thevirustiterisupto109PFU/ml．AftertherecombinantvirusinfectedtargetcellsinthetargetcellshavetheexpressionofMDR1gene．ConclusionMDR1-recombinantadenorirusvectorhasbeensuccessfullyconstructcd．【Keywords】Multi-drugresistancegene(MDR1)；Adenovirusvector；Tran
5、sfection多藥耐藥性（multidrugresistance，MDR）是指腫瘤細(xì)胞能對多種結(jié)構(gòu)、功能及殺傷機(jī)制均不同的化療藥物產(chǎn)生耐受。腫瘤組織多藥耐藥性的產(chǎn)生主要是由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)多藥耐藥基因（MDR1）異常擴(kuò)增和過渡表達(dá)所致，表達(dá)產(chǎn)物為分子量170kd的糖蛋白（P-glycoprotein，P-GP）。該蛋白作為一種依賴ATP能量的大分子藥物或毒物的溢出泵，可把進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物或異物排出細(xì)胞外，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。利用MDR1的這一特性，本研究使用腺病毒作為載體，構(gòu)建MDR1基因-腺病毒重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)導(dǎo)入
6、臍血有核細(xì)胞，對此重組載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的有效性進(jìn)行鑒定。1材料與方法81．1材料PHAMDR質(zhì)粒,美國國立健康研究院GreegarD．Odegaarden博士惠贈；腺病毒載體試劑盒,DNA修平試劑盒，粘粒載體，TaKaRa公司；RPMI1640,GIBCO公司；FCS，TBD公司；DNA純化/回收試劑盒，北京鼎國；MDR1包裝試劑盒，Novagen公司。HEK293細(xì)胞，感受態(tài)大腸桿菌DH5α，由吉林省腫瘤防治研究所保存。1．2MDR1的體外擴(kuò)增將PHAMDR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α[1]，并將此感受態(tài)細(xì)菌接種
7、到含氨芐(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中篩選陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增，用堿裂解法提取PHAMDR質(zhì)粒DNA[2]。1．3擴(kuò)增的PHAMDR質(zhì)粒的鑒定及回收1．3．1PHAMDR質(zhì)粒的鑒定將提取的質(zhì)粒DNA沉淀溶解后用XholI和SacII進(jìn)行雙酶切，然后將質(zhì)粒DNA及過夜雙酶切的質(zhì)粒DNA同時用0．8%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，鑒定MDR1基因擴(kuò)增效果，結(jié)果見圖1、2。1．3．2MDR的回收將電泳所見4．5kb附近的泳帶切回,按DNA回收試劑盒說明進(jìn)行回收，將回收的DNA貯存于-20℃冰箱。1．4MDR1-腺病毒重組表達(dá)載體的構(gòu)建將
8、回收的MDR1基因用DNA修平試劑盒修平后（DNA-TPC），與粘粒載體(CosmidDNA)進(jìn)行連接，用磷酸鈣共沉淀法將Cosmid8DNA和DNA-TPC轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞，2周左右在一些培養(yǎng)孔內(nèi)可以觀察到細(xì)胞的病變和死亡，轉(zhuǎn)移這些已經(jīng)完全死亡培養(yǎng)孔的培養(yǎng)液（含死細(xì)胞）到一個消毒的1．5ml的離心管中，反復(fù)凍融6次后，5000r/min離心5
