腺病毒載體的構建

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1、腺病毒載體的構建病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，分子量為150MDa，直徑約為950，它是已知最大和最復雜的無包膜DNA病毒之一。腺病毒廣泛存在于自然中，能通過呼吸道、消化道、眼黏膜等途徑感染動物和人，無論增殖和非增殖細胞均可以被感染，但對人類的致病性低。由于腺病毒和人類基因組同源，感染后不會整合到人染色體中，不會導致染色體突變。因此，將腺病毒作為抗原呈遞載體構建疫苗，具有高效、安全、給藥方便的優(yōu)點，可以激發(fā)機體天然免疫反應，同時便于保存及成本易控，這些優(yōu)勢使得腺病毒載體成為疫苗研究的熱點。同源重組方法構建腺病毒載體是目前公認的效率較高的方法，但由于受到36Kd腺病毒DNA

2、堿基數(shù)量過大影響，實際效率不高。GibsonAssembly方法是近些年由Dr.DanielGibson發(fā)明了一種新的方法，可以容易的將多個線性DNA片段組合到一起。本研究采用傳統(tǒng)同源重組與GibsonAssembly兩種方法對腺病毒載體進行構建，并做出對比與評價?！　?材料和方法　　1.1主要材料　　質粒pBR322、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌DY330、E1區(qū)、E3區(qū)、蛋白IX缺損的4型腺病毒以及Hela229細胞由中國軍事醫(yī)學科學院8所提供，經PCR及酶切鑒定無誤。質粒提取試劑購買于威格拉斯公司，電擊儀、1mL電擊杯購于Bio-RadMicropulserT

3、M公司，GibsonAssemblyMix試劑購買于NEB公司，Q5Taq酶購買于NEB公司，限制性內切酶購買于寶生物公司?！　?.2實驗方法　　1.2.1腺病毒感染繁殖和DNA提取E1區(qū)、E3區(qū)、蛋白IX缺損的Ad4感染入Hela229細胞，10%胎牛血清EMEM37℃溫箱培養(yǎng)72h，使病毒在細胞內增殖。反復凍融數(shù)次，破壞細胞壁后收集至20mL超濾管5000g離心30min，使含有病毒的培養(yǎng)液濃縮。加入BafferA2mL(100mmol/LTris、150mmol/LNaCl、12.5mmol/LEDTA)到20mL超濾管5000g離心，反復洗滌4次后加入等體積Baffe

4、rB(100mmol/LTris、150mmol/LNaCl、12.5mmol/LEDTA、2%SDS)及1/50體積蛋白酶K，50℃反應30min。酚氯仿抽提及乙醇沉淀得到純凈的DNA。-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。　?.2.2同源重組方法構建腺病毒載體　　1.2.2.1腺病毒載體質粒骨架(pBR-4VLR)構建pBR322質粒用限制性內切酶HindIII切成線性。用PCR擴增兩條同源壁，一端(40bp)與pBR322同源，另一端與AD4兩端同源。左臂長974bp，上游引物CTATCTATATAATATACCTTATTTTTTTTGTG，下游引物GACGAGCAGGCGATTCA

5、GAAC;右臂長853bp，上游引物GCCTCAGGAACAACGATGGAA，下游引物CACAAAAAAAATAAGGTATATTATTGATGA。在DY330中同源重組，使同源臂鏈接在pBR322上?！　?.2.2.2打靶感受態(tài)制備取5μLDY330細胞接于5mL無抗性培養(yǎng)液中，30℃搖床增殖12～16h。取增殖后的菌液300μL加入15mLLB，30℃搖床培養(yǎng)2h，42℃水浴搖床培養(yǎng)12min，冰浴30min，用離心機7500r/min和無菌水在4℃條件下洗滌3次。10%甘油重懸1mL，4℃12000r/min離心機中再洗滌1次，10%甘油200μL重

6、懸?！　?.2.2.3同源重組取40μL感受態(tài)細胞、AD4DNA10ng和pBR-4VLR1.5ng于電擊杯中，電擊儀電擊。電擊打靶條件:電壓1.5kV，電阻300Ω，電容2.5μF。加入無抗LB1mL稀釋，取出500μL涂瓊脂平板，置入30℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑平板中單菌落作鑒定?！　?.2.3GibsonAssembly方法構建腺病毒載體　　1.2.3.1原料擴增pBR322為載體骨架，將3.6kb的AD4DNA分成AD-1、AD-2、AD-3、AD-44段，均用PCR方法擴增，5段原料兩側均設計30bp左右的同源臂。pBR322段(2kb):Q

7、5Taq，上游引物ATTATTGATGATGCGATCGCCATCGGTATCATTACCCCCATG，下游引物TATATTATTGATGATGCGATCGCGAATTCTTGAAGACGAAAGGGCC;條件為98℃預變性5min，98℃30s、64℃30s、72℃1min，3個循環(huán);98℃10s、72℃1min，27個循環(huán);最后72℃延伸2min。PCR產物膠回收純化。AD-1段(8.6kb):Q5Taq，上游引物CTATCTATATAATATACCTTATTTTTTTTGTGTGAGTTAATAT