血管內(nèi)皮生長因子165基因?qū)θ宋赴┘毎忠u性的影響

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1、血管內(nèi)皮生長因子165基因?qū)θ宋赴┘毎忠u性的影響：樂紅琴，歐希龍，杭程，陳慧娟【摘要】目的：探討血管內(nèi)皮生長因子165(VEGF165)基因?qū)ξ赴┘毎忠u性的影響及可能機制。方法：通過體外培養(yǎng)人胃腺癌細胞BGC823，觀察胃癌細胞轉(zhuǎn)染VEGF165基因?qū)ζ溥w移能力及侵襲相關(guān)分子MMP2、uPAmRNA表達的影響。應用Millicell小室分析VEGF165轉(zhuǎn)染前后胃癌細胞遷移能力的變化；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RTPCR)研究VEGF165轉(zhuǎn)染前后BGC823的MMP2、uPAmRNA表達變化。結(jié)果：遷移實驗結(jié)果顯示AdVEGF165組胃

2、癌細胞遷移能力高于AdGFP組及對照組［(212.0000±10.1488)vs(142.6667±14.5028)and(148.3333±7.5718),P<0.05］;RTPCR結(jié)果顯示VEGF165轉(zhuǎn)染后促進了BGC823的MMP2、uPAmRNA表達，AdVEGF165組MMP2、uPA的mRNA水平明顯高于AdGFP組及對照組［MMP2mRNA：（0.6646±0.0486）vs（0.4096±0.0668）and（0.3803±0.0254）；uPAmRNA：（0.8216±0.0798）vs（0.4060±0

3、.1158）and（0.4043±0.0620）;均為P<0.05］。結(jié)論：經(jīng)VEGF165轉(zhuǎn)染后，胃癌細胞遷移能力增強，MMP2、uPA的mRNA表達增加，提示VEGF在腫瘤的侵襲過程中發(fā)揮促進作用，MMP2、uPA可能與此作用有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】血管內(nèi)皮生長因子165;胃癌;侵襲；遷移實驗；基質(zhì)金屬蛋白酶2;尿激酶型纖溶酶原激活物胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和腹膜種植轉(zhuǎn)移是其最常見的轉(zhuǎn)移方式,預后較差。闡明胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制,可以為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的早期診斷和靶向治療提供理論基礎(chǔ)。近年來人們已經(jīng)在人和動物的胃

4、癌組織中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgroatrixmetalloproteinases2，MMP2)、尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinasetypeplasminogenactivator，uPA)分泌的影響，旨在進一步探討VEGF在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及可能機制，對胃癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)的早期診斷及靶向治療有重要意義。1材料和方法1.1材料人胃腺癌細胞株BGC823購自中國科學院，復制缺陷型腺病毒(Ad)重組體AdVEGF165及對照病毒Ad綠色熒光蛋白(GFP)由南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院構(gòu)建并贈送，RPM

5、I1640低糖培養(yǎng)基購自美國Gibcobrl公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。Trizol試劑及RTPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，PCR引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)BGC823用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化后進行傳代，一般1～2d傳1代，1瓶接種2至3瓶，隔日更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。1.2.2病毒轉(zhuǎn)染實驗分成對照組、AdGFP組和AdVEGF165組等3組，以細胞濃度為2.0×105ml-1分別取3ml接種于3個培養(yǎng)瓶

6、(50ml)中，于60%～70%細胞貼壁時吸出原培養(yǎng)液，對照組加入無血清無抗生素RPMI1640培養(yǎng)液3ml，后兩組加入相應的無血清無抗生素RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的病毒液3ml轉(zhuǎn)染［在前期試驗中已經(jīng)測得Ad的感染復數(shù)(MOI)值在20的時候達到最佳的感染效果，本實驗MOI值與前期實驗相同］。8h后換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)36h，對轉(zhuǎn)染前后的細胞行部分生物學特性研究。1.2.3Millicell小室細胞體外遷移實驗分別收集對照組、AdGFP組和AdVEGF165組細胞，用0.25%胰酶消化后,使用無胎牛血清的RPMI16

7、40培養(yǎng)液洗滌細胞3次，制成單細胞懸液，細胞濃度為1×105ml-1。將Millicell小室放入6孔板中，下室中加入1600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,上室加入無胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的單細胞懸液100μl,每組細胞設(shè)3個復孔,置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h，取出濾膜,用95%酒精固定細胞，然后行HE染色，輕輕用棉簽擦凈小室上室面無侵襲性的細胞，顯微鏡下每張濾膜隨機取5個視野,計數(shù)穿膜細胞數(shù),取平均數(shù)表示每組腫瘤細胞的遷移能力。1.2.4RTPCR檢測VEGF165轉(zhuǎn)染前后BGC823的MMP2、uPAmRNA表達

8、變化分組仍為對照組、AdGFP組和AdVEGF165組，按前述方法培養(yǎng)及感染細胞后進行逆轉(zhuǎn)