石油降解菌的分離

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1、從環(huán)境樣品中分離篩選石油降解菌的方案引言隨著經(jīng)濟(jì)技術(shù)的迅速發(fā)展，石油日漸成為我過的主要能源，且需求量日益增大。研究表明，石油生產(chǎn)和運(yùn)輸環(huán)節(jié)會(huì)對(duì)土壤造成嚴(yán)重污染，且污染面積不斷擴(kuò)大。目前，我國石油行業(yè)每年產(chǎn)生的含油污泥多大八十萬噸。由于石油的粘度大、粘滯性強(qiáng)，會(huì)再短時(shí)間內(nèi)形成小范圍的高濃度污染，長(zhǎng)期的石油污染還會(huì)影響土壤的通透性，減少土壤肥力，阻礙植物生長(zhǎng)。同時(shí)，石油中所含的多環(huán)芳香烴具有“三致”效應(yīng)，一些揮發(fā)組分能引起人體麻醉、窒息和化學(xué)性肺炎等疾病。因此，石油污染對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡和人體健康都有很大的危害。目

2、前，針對(duì)石油污染治理的方法主要包括：物理方法、化學(xué)方法以及生物修復(fù)法，但物理方法修復(fù)費(fèi)用較高，耗材較多：化學(xué)方法會(huì)使用大量化學(xué)淋洗劑，很容易造成二次污染。相較而言，微生物修復(fù)技術(shù)由于生產(chǎn)費(fèi)用低、不產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)而被視為一項(xiàng)最具有應(yīng)用前景的修復(fù)技術(shù)。而且隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，無論是DNA文庫的建立，還是多態(tài)性分析方法的進(jìn)步，都為污染物的生物修復(fù)提供了全新的技術(shù)支持。既然生物修復(fù)法有諸多優(yōu)點(diǎn)，那么就應(yīng)該充分發(fā)揮其特性。本文則是著眼于環(huán)境樣品，分離篩選其中的石油降解菌，以擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行更大規(guī)模的石油降解。摘要在長(zhǎng)期被

3、石油污染的土壤中，微生物可逐漸改變自身的代謝條件以適應(yīng)環(huán)境。即以石油烴為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖，同時(shí)將石油烴降解。因此在這種土壤中存在著可降解石油烴的微生物，但石油烴降解菌的篩選、分離是生物法處理石油污染的關(guān)鍵。從這個(gè)角度考慮，以長(zhǎng)期石油污染的土壤中微生物為菌源，從中篩選、分離出高效的石油烴降解菌。要降解哪里的石油就用哪里的土壤培養(yǎng)石油降解菌。目前，國內(nèi)對(duì)極端條件下石油降解微生物研究較少，尤其是對(duì)低溫、耐鹽的石油降解菌，中國北方的大部分濕地，鹽堿程度比較高，成年氣溫較低。無論是來源于海上還是來源于石油化工的污染都比較

4、嚴(yán)重。本文針對(duì)大連開發(fā)區(qū)因石油泄露而被污染的白石灣，就地選取材料進(jìn)行石油降解菌的篩選以及分離研究。一、技術(shù)路線生物修復(fù)是指利用生物的代謝活動(dòng)催化降解偶記污染物，從而去除或消除環(huán)境污染的一個(gè)受控或自動(dòng)進(jìn)行的過程。它利用處理系統(tǒng)中的生物，主要是微生物的代謝活動(dòng)來減少污染現(xiàn)場(chǎng)污染物的濃度或使其他無害化的過程污染物的生物修復(fù)作用，本質(zhì)上是開發(fā)利用微生物的新陳代謝能力以及基因的多樣性，把污染物轉(zhuǎn)化為無污染的中產(chǎn)物，重新進(jìn)入生物地球化學(xué)循環(huán)?！?、菌種的初篩將一定量的樣品置于錐形瓶中,加入生理鹽水,稀釋適宜倍數(shù)后,分別在PD

5、A培養(yǎng)基以及牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布,待表層液體被培養(yǎng)基吸收后,倒置,放于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、菌種的富集將平板上長(zhǎng)勢(shì)良好的20株菌接種到盛有十六烷富集培養(yǎng)基的錐形瓶中,加以標(biāo)記,分別命名為L(zhǎng)ZX21～LZX210(蛋白胨培養(yǎng)基)和LZZ21～LZZ210(PDA培養(yǎng)基)。30℃下恒溫振蕩培養(yǎng)。3、菌種的馴化菌種的馴化過程采用原油液體培養(yǎng)基中原油濃度逐漸升高的方法，取上述富集培養(yǎng)中長(zhǎng)勢(shì)較好的14株菌,依次接種至不同質(zhì)量濃度的原油液體培養(yǎng)基中,于30℃下恒溫振蕩培養(yǎng),以3天為一個(gè)周期,進(jìn)行4個(gè)周期的馴化。

6、馴化后進(jìn)行標(biāo)號(hào)。后將其分別編號(hào)為ODZ21～ODZ27,ODX21～ODX27。4、菌種的復(fù)篩優(yōu)勢(shì)降解菌種的復(fù)篩采用觀察石油降解圈的方法。將菌種點(diǎn)接到一定質(zhì)量濃度的原油平板培養(yǎng)基中,放置到恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時(shí)間后,根椐每個(gè)菌落產(chǎn)生的石油降解圈的大小,挑選優(yōu)良菌種二、樣品采集取大連開發(fā)區(qū)白石灣的海水樣品進(jìn)行分離和篩選三、培養(yǎng)基成分人工海水培養(yǎng)基（MMC）：Nacl24g/L;MgSO4?7H2O7g/L;NH4NO31g/L;KCl0.7g/L;KH2PO420g/L;Na2HPO43.0g/L;PH7.4.滅

7、菌后補(bǔ)加適量微量元素混合液，并補(bǔ)以柴油作為唯一碳源。柴油及微量元素經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。高鹽LB培養(yǎng)基(HLB)：Nacl30g/L;胰蛋白胨10g/L;酵母提取物5g/L;PH7.0.微量元素混合液:CaCl0.02mg/L;FeCl56H2O0.5mg/L;CuSO40.005mg/L;MnCl2·4H2O0.005mg/L;ZnSO4·7H2O0.1mg/L四、培養(yǎng)條件1、溫度：石油烴類微生物降解可在很大的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，在0~70℃的環(huán)境中均發(fā)現(xiàn)有降解石油烴類的微生物。大多數(shù)微生物在常溫下較容易降解

8、石油烴類，且由于某些對(duì)微生物有毒害的低分子量石油烴類在低溫下難揮發(fā)，會(huì)對(duì)石油烴類的降解有一定的抑制作用，所以低溫下石油烴類較難降解。將降解培養(yǎng)基的初始pH調(diào)整到7.5,4株菌接種到50ml含油(原油質(zhì)量濃度為500mg/L)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,分別在25℃、30℃、35℃、40℃、50℃的恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)7d后,測(cè)定原油的降解率,以確定菌株降解原油的最適溫度。2、