掃描電鏡樣品制備

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1、掃描電鏡樣品制備?掃描電子顯微鏡生物樣品制備技術(shù)無論是透射電鏡或是掃描電鏡，樣品均處于電鏡鏡筒的真空之中。而大多數(shù)的生物樣品都是柔軟而且含大量水分的。因此，也和透射電鏡的樣品一樣，在進(jìn)行掃描電鏡觀察前，必須對生物樣品作相應(yīng)的處理。掃描電鏡的功能很多，不同的功能對樣品的要求不同。例如二次電子像與背散射電子像和吸收電子像對樣品的要求基本相同，而與X射線微區(qū)分析對樣品的要求相差較遠(yuǎn)。我們首先介紹二次電子像的生物樣品制備技術(shù)。此外，由于樣品的性質(zhì)不同，其處理方法和程序也有不同。主要分兩大類，一類為含水量少的硬組織，如毛發(fā)、牙齒及植物的花粉、孢子、種子等。此類樣品一般含硅質(zhì)、鈣

2、質(zhì)，角質(zhì)，砝瑯質(zhì)和纖維素等成份，所以通常只經(jīng)過表面清潔、裝臺(粘膠)、導(dǎo)電處理等簡單過程即可進(jìn)行觀察。如要觀察其斷面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)時，經(jīng)斷裂、解剖或酶消化、蝕刻等再裝臺、鍍膜處理，即可進(jìn)行觀察拍照。另-類為含水分較多的軟組織，如大多數(shù)的動植物器官、組織及細(xì)菌等均屬此類。對于此類樣品，在金屬鍍膜前，一般都需經(jīng)過固定、脫水、干燥等處理，如不經(jīng)處理或處理不當(dāng)，就會造成樣品損傷和變形，出現(xiàn)各種假像，因此對每一處理步驟都應(yīng)給予重視。但是，不管是那一類樣品的制備，都應(yīng)達(dá)到以下要求：·盡可能保持樣品活體時的形貌和結(jié)構(gòu)，以便如實(shí)地反映樣品本來面目?！ぴ跇悠返母稍镞^程盡可能減少樣品變形?！?/p>

3、樣品表面應(yīng)有良好導(dǎo)電性能和二次電子發(fā)射率，以防止和減少樣品的荷電效應(yīng)。樣品的前期處理掃描電鏡樣品的前期處理主要包括表面清潔、固定、漂洗和脫水等過程。而每一過程的處理方法基本上都是沿用透射電鏡樣品的處理方法的，所以，這里不一一再作詳述。但是，由于兩種電鏡觀察的要求不同，因此，在處理中也有不同之處：1.透射電鏡主要研究樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)要求內(nèi)部結(jié)構(gòu)保存好，因而樣品宜盡可能小使固定液能迅時滲入固定。掃描電鏡觀察表面形貌，而且為了操作方便選取較大樣品。一般在8～10mm2左右，高度可達(dá)5mm。2.掃描電鏡要求完整且清潔表面，但是在許多樣品的表面常附有粘液、血液、組織液及灰塵等雜物

4、，妨礙著觀察，以致造成對圖像的錯誤解釋，所以，在固定前都必須特別做好表面的清潔工作。以下簡介前期處理方法：清潔'：對樣品的清潔可根據(jù)不同的樣品采用不同的方法，其中常用的方法有:·表面正常干燥的樣品如葉、花瓣、莖等蠟葉標(biāo)本，可用吹氣球或用除塵器吹凈，也可用軟毛筆輕掃等方法除去表面的灰塵和其它雜物，但需注意不要損傷樣品，吹風(fēng)和清掃的力量取決于樣品的硬度和污染的程度?！ひ话銊又参锝M織，可用蒸餾水、生理鹽水或緩沖液漂洗或沖洗。至于采用何種清潔液清洗，要視組織本身對清洗液滲透壓變化的敏感程度而定，如用緩沖液清洗時，應(yīng)與配制固定液的緩沖液一致，否則會因性質(zhì)不同而產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)從而影

5、響固定效果?！τ杏椭置谖锖拖炠|(zhì)覆蓋層的樣品如毛發(fā)、蚧蟲等，應(yīng)采用有機(jī)溶劑反復(fù)浸洗。·對一些附有粘液的組織可采用酶解法或其它試劑處理來清洗，如一般組織可用木瓜蛋白酶和淀粉酶清洗；腸粘膜可用糜蛋白酶清洗；用胰蛋白酶可分離和清洗胃粘膜的細(xì)胞。有些組織也可用試劑進(jìn)行清洗，如要分離神經(jīng)細(xì)胞可用稀釋的乙二胺四醋酸處理，用甘油和稀釋的乙醇延長浸漬時間可以從分泌乳腺中除去乳汁等?！ξ⑿〉臉悠芬秒x心法或放在用鎳過濾網(wǎng)制的小容器中清洗?！τ谔厥獾臉悠愤€須用特殊的方法進(jìn)行清洗。固定:樣品的固定、漂洗和脫水等處理所用的試劑和方法基本上與透射電鏡的樣品相同，但由于掃描電鏡觀察的是樣品

6、的表面，主要是要求保持樣品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脫水過程也與透射電鏡樣品處理有不同之處。除采用戊二醛、四氧化鋨、高錳酸鉀等固定液進(jìn)行固定外，還可采用下列幾種固定液：·Sjodstrand固定液：A液：氯化鈉40.3g+氯化鉀2.1g+鈣0.9g+雙蒸鎦水500mlB液：醋酸鈉9.714g+凡羅那鈉(Veronal)14.74g+雙蒸餾水500m1使用時吸取A液10ml，B液3.4ml，再加0/1mol/L鹽酸11ml和鋨酸05g+50ml蒸餾水·Dalton氏固定液：此種固定液為4％重鉻酸鉀(pH7.2)與3.4％氯化鈉等量混和后，再與2％四氧化鋨等量混使即

7、得。這種固定液無沉渣，對樣品損傷少。在能保持樣品不變形的前提下，不少樣品(特別是植物樣品)采用戊二醛單固定即可。為了加強(qiáng)固定效果，還可將幾種不同的固定液配合使用，進(jìn)行雙固定或多次固定(尤其是動物樣品)；如用用戊二醛作前固定，用鋨酸作后固定。脫水：脫水劑常用乙醇和丙酮。丙酮能使組織塊變硬，是它的優(yōu)點(diǎn)。樣品的干燥生物樣品的制備中，干燥是最關(guān)鍵的步驟。干燥過程除引起樣品收縮之外，水的表面張力會使樣品表面形貌發(fā)生很大的變化，這對掃描電鏡的表面形貌觀察特別有害。在透射電鏡的樣品制備中用乙醇脫水，是為了包埋劑的滲透(因水不與包埋劑互溶，而乙醇則能互溶)。而在掃描