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《氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響論文.freela公司），37℃消化30min，中間振搖1或2次，加入10%的DMEM/F12（美國Gibco公司）5ml，輕輕吹打15次，然后1000r·min-1離心5min，制成單細胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司產(chǎn)品）中，差速貼壁30min，去除成纖維細胞，吸取未貼壁的細胞，并用200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集過濾后的單細胞懸液于培養(yǎng)皿中，然后至離心管中，取一滴單細胞懸液進行計數(shù)，并用DMEM/F12將細胞密度調(diào)到1×106ml-1，然后接種于200μg·
2、ml-1多聚賴氨酸（美國Sigma公司）包被的6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4h后換為無血清培養(yǎng)基，即含2%B27的Neurobasl培養(yǎng)基（美國Gibco公司），以后每3天半量換液1次。使用培養(yǎng)6d的神經(jīng)元進行染色鑒定。1.2大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定1.2.1烯醇化酶（NSE）免疫細胞化學(xué)染色取培養(yǎng)6d6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片進行神經(jīng)元特異的NSE免疫組織化學(xué)染色。棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定1h，加入0.3%H2O2甲醇去除內(nèi)源性過氧化氫酶，0.1%TritonX-100破膜，10%綿羊血清封閉，加入
3、一抗1∶200兔抗鼠NSE抗體，4℃濕盒過夜，0.01mmol·L-1PBS清洗，加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG，放入37℃溫箱孵育60min;0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加SABC過氧化物酶復(fù)合物，37℃溫箱中孵育60min，0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加DAB顯色液作用3～10min，自來水沖洗后，常規(guī)脫水，透明封片。光鏡下觀察NSE表達陽性細胞。1.2.2尼氏染色6孔培養(yǎng)板的細胞培養(yǎng)7d時，取出蓋玻片進行尼氏染色。棄去培養(yǎng)液，0.01mmol·L-1PBS清洗，4%多
4、聚甲醛室溫固定1h，0.01mmol·L-1PBS清洗3次，氯仿中1min，95%、70%乙醇各1min，蒸餾水清洗，置于1%甲苯胺藍染液中染色20min，95%乙醇分化，在顯微鏡下觀察控制，時間以尼氏體顯示清晰為準，37℃干燥，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。1.3實驗分組在培養(yǎng)的第3天加入氟西?。ǔＶ莸谒闹扑帍S生產(chǎn)），根據(jù)藥物濃度不同，將實驗細胞分為5組，分別加入1、10、20、40μmol·L-1氟西汀;正常對照組加入等體積的培養(yǎng)基。1.4海馬細胞形態(tài)定量分析倒置相差顯微鏡（德國Zeis
5、s公司產(chǎn)品）下觀察加藥48h后的海馬神經(jīng)元形態(tài)，每組各孔隨機選擇20個視野（每個視野0.17mm2），記錄每個視野內(nèi)細胞長出突起的神經(jīng)元數(shù)目，目鏡測微尺隨機測量15個神經(jīng)元突起的長度和胞體的長徑。1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析，各項檢測結(jié)果以x-±s表示。多組比較及組間兩兩比較采用方差分析。2結(jié)果2.1海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)1d，細胞絕大部分貼壁，細胞形態(tài)大小不一，以單突起的小細胞為主。培養(yǎng)6d，神經(jīng)元胞體較大，突起進一步增多、延長，并形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)（圖1）。
6、培養(yǎng)12d，神經(jīng)元胞體進一步增大，突起形成比較稠密的網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)24d，神經(jīng)元胞體出現(xiàn)空泡，部分神經(jīng)元死亡，胞體崩解，突觸斷裂。2.2海馬神經(jīng)元鑒定NSE免疫細胞化學(xué)染色:染色后光鏡下觀察第6天的神經(jīng)細胞，胞漿和突起被染成棕黃色為NSE抗體表達陽性細胞，以3個視野中陽性神經(jīng)元的數(shù)目占總細胞的比例為神經(jīng)元純度，經(jīng)鑒定神經(jīng)元的純度為90%。見圖2A。2.3氟西汀對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響結(jié)果見表1和圖3。不同濃度的氟西汀對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)指標的影響是不同的，10μmol·L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比，
7、有突起的神經(jīng)元數(shù)目增加、最長突起長度增長（P0.05）;40μmol·L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比，有突起神經(jīng)元數(shù)目減少（P0.05），最長突起長度及胞體長徑無顯著性差異（P0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比，有突起神經(jīng)元數(shù)目、最長突起長度及胞體長徑無顯著性差異（P0.05）。表1氟西汀對加藥48h海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響（略）3討論本實驗嚴格控制胰酶的量和消化時間，采用了0.25%胰蛋白酶低濃度溶液、30min長時間消化的方法，盡可能減少分離過程中的化學(xué)損傷
8、。為了避免操作過程中的機械損傷，分離時動作輕柔，規(guī)律換藥，每72h半量換液1次，換液時速度快，以減少對神經(jīng)元生長的影響。本實驗采用了差速貼壁生長，去除了成纖維細胞，并采用B27無血清培養(yǎng)基，可以選擇性地促使神經(jīng)元生長，抑制非神經(jīng)元的生長和繁殖［3］，從而可以純化海馬神經(jīng)元。NSE是神經(jīng)元分化成熟的特異性標志酶之一，它主要表達于神經(jīng)元的胞體、軸突、樹突部分［4］，通過NSE免疫細胞化學(xué)染色方法，可以鑒定體外培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)
