抗前列腺特異抗原重鏈可變區(qū)單域抗體基因的構(gòu)建及表達(dá)論文

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1、抗前列腺特異抗原重鏈可變區(qū)單域抗體基因的構(gòu)建及表達(dá)論文.freelAb的雜交瘤細(xì)胞系E4B7中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增VH單域抗體基因,將其克隆到融合蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-1中進(jìn)行表達(dá).結(jié)果VH單域抗體基因全長(zhǎng)363bp,含起始碼和終止碼.將其克隆到pGEX-4T-1內(nèi),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,獲得高效表達(dá),表達(dá)量占全菌總蛋白質(zhì)的38%.freelainantibody;cloning;expressionAbstract:AIMToamplifytheVHsingledomaingeneofan-ti-prostatespecificantigen(

2、PSA)monoclonalantibody(mAb),andexpressitinE.coli.METHODSTotalRNAthehybridomacelllineE4B7,ainantibodygeneplifiedbyPCR,clonedintotheprokaryoticfusionproteinexpres-sionvectorpGEX-4T-1andexpressedinE.coli.RESULTSTheVHsingledomainantibodygeneconsistedof363bp,edintoE.coliDH5α.Clonesharborin

3、gplasmidpGEX-VHproduceda40kDaoffusionproteininE.coliatalevelof38%ofthetotalcellularprotein.Afterprimarypu-rificationandrenaturation,thefusionproteinatography.ThefusionproteinbinandtheVHsingledomainanti-bodyainantibodyedbypetitivebindingin-hibitionassayinvitro.CONCLUSIONAnti-PSAsingled

4、o-mainantibodyhasbeensuccessfullyconstructedfortheuseinclinicalstudies.0引言前列腺特異抗原(Prostatespecificantigen)是一種靈敏度較高的前列腺癌腫瘤標(biāo)志物,131I標(biāo)記抗PSA單克隆抗體用于前列腺癌放射免疫顯像,有較高的靈敏度和特異性[1].針對(duì)鼠源性單克隆抗體對(duì)人體存在著免疫原性的問題,自20世紀(jì)80年代以來基因工程抗體的研究愈來愈受到重視,其中重鏈可變區(qū)(VH)單域抗體由于只有一個(gè)功能區(qū),保留了較好的抗原結(jié)合能力,在制備和應(yīng)用上有其優(yōu)點(diǎn).我們應(yīng)用RT-PCR方法從抗P

5、SA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系E4B7中擴(kuò)增出VH單域抗體基因,在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá),并進(jìn)行親和活性測(cè)定.1材料和方法1.1材料E.coliDH5α受體菌,本室保存.質(zhì)粒pUC19和pGEX-4T-1由本校生物化學(xué)教研室白玉杰博士惠贈(zèng).小鼠雜交瘤細(xì)胞系E4B7由本室制備,保存并培養(yǎng).人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3,由北京醫(yī)科大學(xué)病理教研究室從美國引進(jìn).反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega);RapidDNALigationKit(BoehringerMannheim);AdvantageTMPCR-PureKit(Clon-Tech);PlusMiniprepsDNAPur

6、ificationSystem(Promega);各種限制性內(nèi)切酶,核酸分子質(zhì)量標(biāo)記物,凝血酶等購自華美公司和Promega公司.PCR引物HeavyPrimer1和2:Pharmacia公司產(chǎn)品,是噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)中的混合引物.設(shè)計(jì)一對(duì)含有EcoRI-起始碼和終止碼-SalI的VH引物,上游引物A為:5′-GCGAATTCATGCAGGTCCAACTGCAGGA-3′,下游引物B為:5′-GCGTCGACTTATGAGGA-GACGGTGACCGTGG-3′,該引物在美聯(lián)(西安)生物公司合成.1.2方法1.2.1細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄培養(yǎng)小鼠雜交瘤細(xì)胞E4B7

7、,至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.收集細(xì)胞2×107個(gè),提取細(xì)胞總RNA[2],逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按ReverseTran-scriptionsystem,USAPromega說明書進(jìn)行.1.2.2VH基因的PCR擴(kuò)增采用PE公司2400型擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng),第一輪PCR應(yīng)用引物HeavyPrimer1和2,擴(kuò)增條件是先94℃預(yù)變性5min,后按94℃60s,55℃90s,72℃120s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后,繼續(xù)在72℃延伸10min.取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行15gL-1瓊脂糖凝膠電泳分析,用AdvantageTMPCR-PureKit回收,以回收物為模板,用引物A和B進(jìn)行第二輪PCR.1.2.3V

8、H基因的克

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