標記hrp——簡易過碘酸鈉法

《標記hrp——簡易過碘酸鈉法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、標記HRP——簡易過碘酸鈉法1.　原理：經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO４氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體試劑及器材(1)　0.1M?NaIO４：稱取24.1mg高碘酸鈉溶于1ml蒸餾水中。(2)　1mM?pH4.4醋酸鈉緩沖液:0.2M?NaAc?(1.361克／50ml)?3.7ml0.2M?HAc?(0.60

2、1ml／50ml)?6.3ml加蒸餾水至2,000ml。(3)　0.2M?pH9.5碳酸鹽緩沖液:Na２CO３?0.32克NaHCO３?0.586克加蒸餾水至50ml再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M?pH9.5的碳酸鹽緩沖液。(4)　NaBH４溶液(4mg／ml):臨用時稱取NaBH４4mg溶于1ml蒸餾水中。(5)?0.15M?pH7.4?PBSKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2g加蒸餾水至1000mL。（6）??飽和硫酸銨操作步驟(1)　稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。(2)　于上液中加入0.2m

3、l新配的0.1M?NaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混勻，?靜置30分鐘。(3)　將上述溶液裝入透析袋中，對1mM?pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。(4)　加20μl?0.2M?pH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入2mg?IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml?0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。(5)　加0.1ml新配的4mg／ml?NaBH４液，混勻，再置4℃2小時。(6)　將上述液裝入透析袋中，對0.15M?pH7.4?PBS透析，4℃過夜。結(jié)

4、果判定定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程1cm)。酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62　　　　　　　　　酶量(mg／ml)　　??IgG量(mg／ml)?　??酶量克分子比值＝────────?÷?───────?＝?───?×?4　　　　　　　　40,000?　　　　　　160,000　　　???IgG量注意事項（1）為提高標記效率，應嚴格掌握整個反應體系中的抗體含量。（2）碘酸鈉要新鮮配制。(3)?在氧化HRP時，以pH5.6醋酸鹽緩沖液溶解酶為宜。(4)?一般認

5、為氧化HRP?5mg，?NaIO4量以0.06mol/L?0.5ml為宜，不能低于0.015mol/L?0.5ml。(5)?氧化HRP時間以15-30min為宜。(6)?加入DNFB的目的是為了封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。(7)?加入乙二醇的目的是終止反應；為便于在加入抗體后調(diào)pH值，故乙二醇要用0.05mol/L?CBS配制。