臍靜脈和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的比較研究

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1、臍靜脈和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的比較研究*中國生物工程雜志ChinaBiotechnology,2006,26(1):6～10唐曉瓊趙智剛王紅祥鄒萍**(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所武漢430022)摘要間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的來源有限，成人骨髓是MSCs的主要來源，這極大地限制了其在實(shí)驗(yàn)和臨床中的應(yīng)用。為拓寬MSCs來源，從細(xì)胞形態(tài)、生長特性、免疫表型和多向分化能力等四個(gè)方面對(duì)人臍靜脈來源和成人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，人臍靜脈來源和成人骨髓來源的MSCs具有相似的生物學(xué)特征，成纖維細(xì)胞樣形態(tài)生長，并具有強(qiáng)大的體外擴(kuò)增和多向分

2、化能力。人臍靜脈來源的MSCs可替代成人骨髓MSCs，作為滿足實(shí)驗(yàn)和臨床需要的重要來源。關(guān)鍵詞間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓臍靜脈中圖分類號(hào)Q8131收稿日期：20050621修回日期：20050921*湖北省科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2005AA304B03)**通訊作者，電子信箱：zouping@public.wh.hb.cn隨著基因工程和細(xì)胞組織工程的興起,對(duì)于種子細(xì)胞的研究成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenthymalstemcells,MSCs)是來源于發(fā)育早期中胚層的一類多能干細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下可以分化成為多種類型的結(jié)締組織，形成骨、軟骨、骨骼

3、肌、肌腱和脂肪等多種組織［1］，而且具有采集方便，易于體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和誘導(dǎo)等特性，被認(rèn)為是一種理想的種子細(xì)胞。目前用于實(shí)驗(yàn)和臨床的MSCs來源尚有限，因此，我們分別獲取人臍靜脈來源和成人骨髓來源的MSCs，體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，比較了二者的形態(tài)、生長特性、表面標(biāo)志、細(xì)胞周期、多向分化等特點(diǎn)，為拓寬用于實(shí)驗(yàn)和臨床的MSCs來源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1試劑IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清均為GIBCO公司產(chǎn)品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLADR抗體購自PharMingen。膠原酶Ⅱ、胰酶、乙二胺四乙酸(EDTA)、

4、1甲基3異丁基黃嘌呤和纖連蛋白購自Sigma公司。1.2研究對(duì)象8份臍帶取自8名足月分娩的健康產(chǎn)婦，5份正常成人骨髓取自5名20～35歲的健康志愿獻(xiàn)髓者。1.3臍靜脈來源的MSCs分離培養(yǎng)無菌條件下取新生兒臍帶20~30cm,用無菌生理鹽水沖洗，去除臍靜脈中的瘀血，以1%的膠原酶Ⅱ注入臍靜脈后封閉臍帶兩端，37℃孵育15min，抽出消化液，用生理鹽水沖洗臍靜脈2次，以400g離心15min,去上清，計(jì)數(shù)后以1×105個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種于含2mol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、10%FCS的IMDM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2培

5、養(yǎng)箱中，24h后換液，去除未貼壁細(xì)胞及雜質(zhì)細(xì)胞。以后每3d換液1次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，按常規(guī)方法以002%EDTA0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng),取傳代3次以上的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.4骨髓來源的MSCs分離培養(yǎng)經(jīng)肝素抗凝的成人骨髓,用Dhank’s倍比稀釋后,以淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll,1.077g/ml)梯度離心(400g，20min),吸取白環(huán)以上細(xì)胞部分，用Dhank’s離心洗2次,細(xì)胞計(jì)數(shù),并以1×105個(gè)細(xì)胞/cm2接種，在與上述相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。1.5細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)1.5.1細(xì)胞形態(tài)觀察分別取第4、7、10代MSCs，置于3.5cm直徑平皿

6、中進(jìn)行細(xì)胞爬片培養(yǎng)3d后，瑞氏染色，倒置顯微鏡下觀察染色前后細(xì)胞形態(tài)。并且取第7代MSCs用2.5%戊二醛4℃過夜固定，經(jīng)PBS洗滌,1%鋨酸4℃固定1h,丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹脂Ep0812包埋,常規(guī)超薄切片。醋酸鈾枸櫞酸鉛染色,在H2100電子顯微鏡下觀察、照相。1.5.2細(xì)胞生長曲線測定將1×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每隔1d取2孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，繪制生長曲線。1.5.3細(xì)胞周期測定將1×106個(gè)細(xì)胞置于70%冰乙醇中固定20min（4℃），PBS洗滌2次，40μg/mlRNasin中處理20min（37℃），PBS洗滌2次

7、，50μg/mlPI(Sigma,USA)染色5min，用FACScalibur流式細(xì)胞儀檢測,使用cellquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。2006,26(1)唐曉瓊等：臍靜脈和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的比較研究中國生物工程雜志ChinaBiotechnologyVol.26No.120061.5.4MSCs免疫表型分析分別取第4、7、10代MSCs經(jīng)胰酶消化后，用含20g/LBSA的PBS制成1×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。每個(gè)上機(jī)試管中加入500μl細(xì)胞懸液，再加入鼠抗人CD13、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD1