利用srap分子標(biāo)記分析種質(zhì)資源 實驗方案

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1、利用SRAP分子標(biāo)記分析種質(zhì)資源1SRAP分子標(biāo)記相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）是由美國加州大學(xué)Li和Quiros于2001年發(fā)展的一種基于PCR反應(yīng)的新型標(biāo)記。該技術(shù)是基于正向和反向引物對模板DNA的PCR擴增，引物具有3個明顯不同的序列框(motif)：5’端存在的10-11個隨機堿基序列，緊跟著CCGG（正向引物）或AATT（反向引物）的堿基序列，最后是位于3’端的3個選擇性堿基。從技術(shù)的可操作性來看，每個引物5’端的10個隨機堿基序列可以促進(jìn)任意序列的擴增，即類似于RAPD標(biāo)記的結(jié)果。正向引物的CCGG序列可以優(yōu)先與

2、具有豐富GC堿基的外顯子序列退火結(jié)合，而反向引物的AATT序列可優(yōu)先與具有豐富AT堿基的內(nèi)含子和啟動子序列退火結(jié)合，引物3’端的3個選擇性堿基可以對模板DNA進(jìn)行選擇。SRAP標(biāo)記自開發(fā)以來，已在多種植物的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建和物種親緣關(guān)系分析研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。該標(biāo)記具有操作簡便、快速，多態(tài)性豐富，重復(fù)性好，不需預(yù)知物種序列信息以及成本較低等優(yōu)點，具有RAPD簡單快捷之優(yōu)點，同時還具有AFIP的穩(wěn)定性和多態(tài)性，是簡單又經(jīng)濟(jì)、有效又可靠的分子標(biāo)記系統(tǒng)。2.1材料和試劑2.1.1材料從各種中各隨機選取5-15株個體

3、采集葉片用于提取基因組DNA。2.1.2儀器與試劑研缽、冷凍高速離心機、水浴鍋、紫外分光光度計、電泳槽、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀液氮、離心管（1.5mL、10mL）、PCR管、燒杯、容量瓶、試劑瓶、量筒氯化鈉、EDTA二鈉鹽、醋酸鈉、Tris、CTAB、鹽酸、β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、冰醋酸、無水乙醇、PCR試劑、瓊脂糖（1）2×CTAB提取液配制2×CTAB提取液配制2×CTAB提取液終濃度母液5ml10ml15ml20ml1.4mMNaCl5MNaCl1.42.84.25.620mMEDTA0.5MEDT

4、A0.20.40.60.8100mMTris-HCl(pH8.0)1MTris-HCL,pH8.00.51.01.52.02%(w/v)CTAB10%(w/v)CTAB1.02.03.04.00.2%(v/v)β-mercaptoethanolβ-mercaptoethanol0.010.020.030.04H2OH2O1.893.785.677.56（2）5MNaCl（3）0.5MEDTA-Na2（pH8.0）（4）1MTris-HCL（pH8.0）（5）10%(w/v)CTAB（6）0.2%(v/v)β-mercapto

5、ethanol（7）氯仿、異戊醇混合液（24:1）（8）3MNaAc（9）TE：10mMTris-HCl，1mMEDTA,pH7.4（10）50×TAE電泳緩沖液（1L）：Tris242g冰醋酸57.1ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml工作液為1×TAE（40mmol/LTris-HAc,1mmol/LEDTA）2.2基因組DNA的提取(CTAB法)和檢測采用改良CTAB法提取基因組DNA，具體步驟如下：（1）取干燥葉片0.1g左右于研缽中，加液氮研磨成粉末，待液氮揮發(fā)完畢，將粉末迅速轉(zhuǎn)移至離心管中；（2）

6、加入65°C預(yù)熱的3mL2×CTAB提取液，65oC水浴30min，期間稍加混勻；（3）加入等體積氯仿、異戊醇混合液（24:1，4mL），搖勻靜止3min后室溫離心10min（10000r·min-1）；（4）取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，用0.8V冷異丙醇（或2V預(yù)冷的無水乙醇）/0.1V3MNaAc沉淀DNA，-20℃下放置30min以上；（5）4°C離心15min（12000r·min-1）；（6）棄上清，沉淀用70%預(yù)冷乙醇洗滌兩次，自然風(fēng)干，加適量TE溶解；（7）加RNaseA至終濃度10μg/ml，37oC消化30m

7、in；（8）加等體積氯仿、異戊醇混合液（24:1），翻轉(zhuǎn)充分搖勻，室溫離心10min（12000r·min-1）；（13）取上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，加入.8V冷異丙醇（或2V預(yù)冷的無水乙醇）/0.1V3MNaAc沉淀DNA，輕輕翻轉(zhuǎn)搖勻，-20°C冰箱過夜；（14）4°C離心15min（12000r·min-1），棄上清，70%預(yù)冷乙醇洗滌沉淀兩次，無水乙醇洗滌一次，并自然風(fēng)干；（15）加入100μlTE溶液，冷凍備用?；蚪MDNA濃度檢測用紫外分光光度計（日本島津UV-2401PC）測定260nm/280nm處的光吸

8、收值，根據(jù)A260/A280確定DNA的純度，根據(jù)260nm處的光吸收值估測樣品DNA的濃度；用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的純度和濃度來檢測其純度和濃度，根據(jù)電泳條帶的整齊度、點樣孔中熒光的有無估計DNA的純度，根據(jù)條帶的亮度估測DNA的濃度。2.3PCR反應(yīng)體系及程序用于PCR擴