分離純化蛋白質(zhì)的方法及原理

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1、（二）利用溶解度差別影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、離子強度；3、介電常數(shù)；4、溫度。但在同一的特定外部條件下，不同蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。1、等電點沉淀：原理：蛋白質(zhì)處于等電點時，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他條件相同時，他的溶解度達到最低點。在等電點之上或者之下時，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號的凈電荷而互相排斥，阻止了單個分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，利用蛋白質(zhì)在等電點時的溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。當(dāng)pH被調(diào)到蛋白質(zhì)混合物中其中一種蛋白質(zhì)的等電點時，這種蛋白質(zhì)大部分

2、和全部被沉淀下來，那些等電點高于或低于該pH的蛋白質(zhì)則仍留在溶液中。這樣沉淀出來的蛋白質(zhì)保持著天然的構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。5、鹽析與鹽溶：原理：低濃度時，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)溶解度這種現(xiàn)象稱為鹽溶.鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用卻加強，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析過程中往往沉淀析出，這就是因為透析除去了鹽類離子，使蛋白質(zhì)分子之間的相互吸引增加，引起蛋白質(zhì)分子的凝集并沉淀。當(dāng)溶液的離子強度增加到一定程度時，蛋白質(zhì)溶解程度開始下降。當(dāng)離子強度增加到足夠高時，例如飽和或

3、半飽和程度，很多蛋白質(zhì)可以從水中沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用主要是由于大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。此時那些被迫與蛋白質(zhì)表面的疏水集團接觸并掩蓋他們的水分子成為下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶劑化鹽離子，留下暴露出來的疏水基團。蛋白質(zhì)疏水表面進一步暴露，由于疏水作用蛋白質(zhì)聚集而沉淀。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)保持著他的天然構(gòu)象，能再溶解。鹽析的中性鹽以硫酸銨為最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的溫度系數(shù)較低。3、有機溶劑分級分離法：與水互溶的有機溶劑（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低

4、。在室溫下有機溶劑會引起蛋白質(zhì)變性，如果預(yù)先將有機溶劑冷卻到-40°C以下，然后在不斷攪拌下逐滴加入有機溶劑，以防局部濃度過高，那么變性可以得到很大程度緩解。蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度也隨溫度、pH和離子強度而變化。在一定溫度、pH和離子強度條件下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機溶劑的濃度不同，因此控制有機溶劑濃度也可以分離純化蛋白質(zhì)。有機溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。有機溶劑的加入使水溶液的介電常數(shù)降低。介電常數(shù)的降低將增加兩個相反電荷之間的吸引力。蛋白質(zhì)分子表面可解離基團的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。水溶性非離子聚

5、合物如聚乙二醇與蛋白質(zhì)親水集團發(fā)生相互作用并在空間上阻礙了蛋白質(zhì)與水相接近。蛋白質(zhì)在聚乙二醇中的溶解度明顯的依賴于聚乙二醇的分子量。4、溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響：在一定溫度范圍內(nèi)，約0~40℃之間，大部分球狀蛋白的溶解度隨溫度升高而增加，在40~50℃以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進行。（三）根據(jù)電荷不同根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷不同即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。1、電泳：在外電場的作用下，帶點顆粒將向著與其電性相反的電極移動

6、，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)可用于氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和核苷酸等生物分子的分析分離和制備。區(qū)帶電泳是由于在支持物上電泳蛋白質(zhì)混合物被分離為若干區(qū)帶。電泳前用緩沖液浸潤薄膜或濾紙等支持物或用緩沖液直接配置成凝膠，將待分離的蛋白質(zhì)樣品加在它的一端或中央，支持物的兩端與電極連接，通電電泳。電泳完畢，各個組分分布在不同的區(qū)域，用顯色劑（蛋白質(zhì)可用考馬斯亮藍或氨基黑等染色）顯色后可以顯示出各個組分。氨基酸混合物特別是寡聚核苷酸混合物一次電泳往往不能完全分開。這種情況可以將第一次電泳分開的斑點通過支持介質(zhì)間的接觸印跡轉(zhuǎn)移到第二個支持介質(zhì)上，旋轉(zhuǎn)90°，進行第二次電泳。這種方法稱為雙向

7、電泳。2、聚丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的兩部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分為分離膠），這兩部分凝膠的濃度、緩沖液組分和離子強度、pH以及電場強度都是不同的，即不連續(xù)性。電泳時樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶，然后再進行電泳分離。電泳有三種物理效應(yīng)：1、樣品的濃度效應(yīng)；2、凝膠對被分離分子的篩選效應(yīng)；3、一般電泳分離的電荷效應(yīng)。1、毛細管電泳：高效毛細管電泳、毛細管區(qū)帶電泳、自由溶液毛細管電泳、毛細管電泳，可分離氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、DNA片段和核酸以及多種小分子，也