蛋白質(zhì)的分離純化

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1、蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化主要包括“前處理”，“粗分級(jí)”，“細(xì)分級(jí)”三個(gè)步驟，本文主要講述“細(xì)分級(jí)”，即粗提的蛋白質(zhì)分離純化的方法。蛋白質(zhì)的分離純化方法根據(jù)蛋白質(zhì)不同的生理特性有不同的方法分類(lèi)，主要根據(jù)以下幾個(gè)性質(zhì)來(lái)設(shè)計(jì)純化方法：一、根據(jù)分子大小不同分離純化：蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì),并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，因此可以利用一些較簡(jiǎn)單的方法使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)，并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過(guò)濾等。1、透析和滲濾：主要利用半透膜透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液進(jìn)行分離。超濾是利用離心力

2、或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過(guò)程。這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無(wú)機(jī)鹽為主的小分子分開(kāi)。它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用，在進(jìn)行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無(wú)機(jī)鹽。由于超濾過(guò)程中，濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質(zhì)的分子量也越來(lái)越小。所以在使用超濾方法時(shí)要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過(guò)濾得到更理想的效果。2、離心離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時(shí)可以利用離心的方法將它們分開(kāi)。例如，在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，加入纖維素酶和α-淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理后，再用離心的方

3、法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進(jìn)行初步分離。3、凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾也稱(chēng)凝膠滲透層析,是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一。凝膠過(guò)濾的原理是當(dāng)不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而被排阻在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運(yùn)動(dòng)并最先流出柱外；反之,比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。一、根據(jù)溶解度不同分離純化影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多，比如溶液的pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等。但在同一條件下，不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度,根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),適當(dāng)?shù)馗?/p>

4、變外部條件，就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度,達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等。1、等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法。每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點(diǎn),而且在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低；相反，有些蛋白質(zhì)在一定pH值時(shí)很容易溶解。因而可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值來(lái)分離純化蛋白質(zhì)。2、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象,其中,增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱(chēng)鹽溶,反之為鹽析。同樣濃度的二價(jià)離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對(duì)蛋白質(zhì)溶解度影

5、響的效果,要比一價(jià)離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。由于硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對(duì)蛋白質(zhì)的破壞,應(yīng)用氨水調(diào)pH值至中性。為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象,蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0·2%~2·0%。利用鹽溶和鹽析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提純后，通常要使用透析或者凝膠過(guò)濾的方法除去中性鹽。3、有機(jī)溶劑法原理：與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此，控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋

6、白質(zhì)。由于在室溫下,有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀,而且伴隨著變性。因此，通常要將有機(jī)溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下加入有機(jī)溶劑防止局部濃度過(guò)高,蛋白質(zhì)變性問(wèn)題就可以很大程度上得到解決。對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中極性側(cè)鏈較多、不溶于水的蛋白質(zhì)，可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑提取，它們有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性，是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規(guī)程和中國(guó)生物制品規(guī)程推薦的方法,不僅分辨率高、提純效果好、可同時(shí)分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。4、雙水相萃取法雙水相萃取技術(shù)是指親水性聚

7、合物水溶液在一定條件下形成雙水相，由于被分離物在兩相中分配的不同，便可實(shí)現(xiàn)分離,被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。此方法可以在室溫環(huán)境下進(jìn)行，雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,收率較高。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì),需要先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到濃縮,細(xì)胞碎片等固體物分布在下相中。采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強(qiáng)度、鹽類(lèi)型及濃度的影響。5、反膠團(tuán)萃