腸道菌群細菌的鑒定

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1、腸道菌群細菌的鑒定一、實驗目的1.掌握革蘭染色法。2.掌握IMViC試驗。二、儀器與試劑玻片，接種環(huán)，生理鹽水，酒精燈，結晶紫溶液，盧戈氏染液，石炭酸-復紅溶液，沙黃液，光學顯微鏡，二甲基氨基苯甲醛試劑，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，甲基紅試劑（甲基紅0.02g，95%酒精60mL，蒸餾水40mL），6%α-萘酚酒精溶液，40%KOH，銨鹽作為唯一氮源，并利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源的培養(yǎng)基，層析濾紙，正丁醇，甲酸，1.5%乳酸，1.5%乙酸溶液，3%溴甲酚藍酒精溶液，層析缸，需氧血瓊脂平板，厭氧血瓊脂平板，七葉苷培養(yǎng)基，膽汁七葉苷培養(yǎng)基，65g/LNaCl血清肉湯，PYR試劑，DNA瓊脂平板，1mo

2、l/L鹽酸，MRS培養(yǎng)基，X-Gal。三、實驗步驟1.革蘭染色法（1）涂片：取玻片在火焰上稍微加溫，以清潔紗布擦凈，放置桌上，左手握培養(yǎng)皿，右手持接種環(huán)，用無菌接種環(huán)取生理鹽水一滴，置于載玻片的中央，再用接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷卻后，取培養(yǎng)細菌少許與鹽水混勻，直接取1~2環(huán)菌液作涂片即可，涂片應厚薄均勻。接種環(huán)采菌后，要通過火焰滅菌才能放下。（2）干燥：目的是是菌體水分慢慢蒸發(fā)，固定菌形。涂片最好在室溫中自然干燥，必要是將標本面向上，小心斷續(xù)在弱火高處略烘，以助水分蒸發(fā)；但切勿緊靠火焰，以致標本烤枯，不堪檢視。（3）固定：手執(zhí)玻片一端，標本面向上，在火焰外層快速地來回通過三次，共2-3秒，

3、以玻片反面觸及皮膚不覺過燙為度。冷卻后，染色。目的是殺死細菌，是菌體與玻片粘附較牢以及改變對染料的通透性，因活的細菌一般不能使許多染料進入細胞。?（4）初染：將涂片標本夾持于左手，滴加結晶紫溶液蓋滿涂抹面，染色1~3分鐘，用流水緩緩沖洗（即將龍頭打開使水緩慢流出，將玻片傾斜使水在玻片面上端沿玻片流下沖洗染液）直至無顏色流下為止。（5）媒染：加盧戈氏染液4~5滴作用30秒到一分鐘，再按上法沖洗，并將片上積水輕輕灑凈。（6）脫色：在95%酒精缸中脫色約3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反復2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色為止，現(xiàn)按上法以流水沖洗，并將玻片輕輕灑凈。（7）復染：用稀釋石炭酸

4、-復紅（或沙黃液）復染半分鐘后按上法沖洗。（8）光學顯微鏡下觀察細菌染色情況（9）G+菌被染成紫色；G-菌被染成紅色。?2.大腸桿菌（1）革蘭染色法實驗結果應為被染成紅色，即G-菌。?（2）IMViC試驗靛基質（吲哚）試驗斑點試驗法：將一片濾紙放在培養(yǎng)皿的蓋子上或一張載玻片上，滴加1~1.5mL二甲基氨基苯甲醛試劑液于濾紙上使其變濕，取18~24h瓊脂平板培養(yǎng)物涂布于浸濕的濾紙上，在1~3min內觀察。棕色的試劑由紫紅變?yōu)榧t色者即為陽性。甲基紅（MR）試驗：取一種細菌的24h培養(yǎng)物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)48~72h，取出后加甲基紅試劑3~5滴，立即觀察結果。如果培養(yǎng)液

5、呈紅色者為陽性，橙色者為可疑，黃色者為陰性。二乙酰（V-P）試驗：將被檢細菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基后，于35~37℃培養(yǎng)48h，于2mL培養(yǎng)液內加入甲液（6%α-萘酚酒精溶液）1mL和乙液（40%KOH）0.4mL，搖振混合。試驗時強陽性者約于5min后，可產生粉紅色反應。如長時間無反應，置室溫過夜，次日不變者為陰性。枸櫞酸鹽利用試驗：將被檢細菌少量接種到培養(yǎng)基（銨鹽作為唯一氮源，并利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源）中，37℃培養(yǎng)2~4d，觀察培養(yǎng)基顏色變化。培養(yǎng)基變藍色，陽性；不變，陰性。實驗結果應分別為：陽性，陽性，陰性，陰性。3.乳酸桿菌（1）革蘭染色法實驗結果應為被染成紫色，即G+菌。

6、?（2）乳酸紙層析法層析濾紙的制備——將層析濾紙剪成1.5cm*11cm的長條狀，在距層析紙一端約4cm處用鉛筆劃線確定點陽線，使用前充分干燥。配制展開劑——正丁醇:甲酸:水=80:15:5配制標準液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液。制備待測樣品——將培養(yǎng)基菌種加入生理鹽水37℃培養(yǎng)24h后離心，收集上清液離心，收集上清液。點樣——用毛細管分別吸取發(fā)酵液，多次點樣于濾紙條上，樣點直徑不宜超過2mm，平衡2h層析——將點好樣的層析紙放入，使點有樣品的一端浸在展開劑中，但不可浸及樣點。觀察展開情況，待展開劑前沿到達離層析紙另一端約1.5cm處，取出層析紙。顯色——以3%溴甲酚藍酒精溶

7、液為顯色劑，待層析液揮發(fā)之后，向層析濾紙噴灑并計算Rf值。實驗結果Rf值應該一致。4.脆弱擬桿菌耐氧試驗從每個瓊脂平板上挑取4~5個性狀不同的菌落，每個菌落分別轉種于2塊需氧血瓊脂平板和1塊厭氧血瓊脂平板(每個瓊脂平板可劃4~6區(qū)，每區(qū)種一個可疑菌落)，然后將平板分別放置在需氧、二氧化碳和厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。實驗結果應為在厭氧環(huán)境生長，而在需氧和二氧化碳環(huán)境中不生長。5.腸球菌（1）革蘭染色法實驗結果應為被染成紫色，即G+菌