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《rna干擾技術(shù)的原理與應(yīng)用》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、RNA干擾技術(shù)的原理與應(yīng)用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是通過小干擾RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)造成目的mRNA特異性降解,從而使基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種現(xiàn)象。這一現(xiàn)象廣泛存在于自然界,是生物體進(jìn)化過程中抵御外來基因侵害的一種機(jī)制,為穩(wěn)定基因組發(fā)揮了重要作用。由于RNAi可以作為一種簡單、有效的代替基因剔除的遺傳工具,正在功能基因組學(xué)領(lǐng)域掀起一場真正的革命,并將加快這個領(lǐng)域的研究步伐。1RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展1995年,Guo等用反義RNA阻斷秀麗新小桿線蟲的part
2、1基因的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),正義和反義RNA都阻斷了該基因的表達(dá),這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋相反。1998年2月卡耐基研究院的Fire等將雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),發(fā)現(xiàn)靶基因的mRNA發(fā)生了降解,證實(shí)高度純化的dsRNA可以高效特異的阻斷相應(yīng)的基因表達(dá),而且效率比單鏈RNA至少高2個數(shù)量級,首次揭示了Guo等遇到的現(xiàn)象,即為RNAi。隨后研究發(fā)現(xiàn),RNAi現(xiàn)象廣泛存在于各種生物中,是一種古老的重要保護(hù)機(jī)制,RNAi技術(shù)作為一種重要的研究手段大大加速了基因組學(xué)的研究進(jìn)程,現(xiàn)已成為基因
3、功能研究和基因治療研究的熱點(diǎn)。在短短幾年中,對RNAi的研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展,許多令人振奮的報(bào)道相繼出現(xiàn),2001年首次報(bào)道了在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中成功應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制基因表達(dá),開創(chuàng)了RNAi技術(shù)應(yīng)用于高等生物基因功能研究的先河;2002年,Kay研究小組首次報(bào)道了應(yīng)用RNAi技術(shù)在哺乳動物整體水平進(jìn)行基因表達(dá)沉默的實(shí)驗(yàn)研究;2004年哺乳動物全基因組范圍RNAi研究也取得了重要進(jìn)展,先后報(bào)道了用酶法構(gòu)建全基因組siRNA文庫新技術(shù)和應(yīng)用基因組siRNA文庫,從全基因組水平對高等動物基因功能進(jìn)行高通量RNAi研究。這些研究
4、成果愈來愈表明,生物體基因轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)物不僅僅是蛋白質(zhì),還包括相當(dāng)一部分RNA。2RNAi的作用機(jī)制細(xì)胞中dsRNA的存在是RNAi形成的先決條件。dsRNA可以通過多種途徑在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生。通過對RNAi所進(jìn)行的遺傳學(xué)和生物化學(xué)的研究,現(xiàn)已初步闡明了其作用機(jī)制。RNAi的作用機(jī)制可分為三個階段:起始階段、效應(yīng)階段和級聯(lián)放大階段。起始階段:由RNA病毒入侵,轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄,基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄等所產(chǎn)生的dsRNA分子在細(xì)胞內(nèi)被一雙鏈RNA酶!型內(nèi)切酶也叫Dicer酶或Dicer核酸酶同源物剪成21~23ntsiRNA,3
5、’端帶有2個堿基突出的黏性末端,5’為磷酸基團(tuán),此結(jié)構(gòu)對于siRNA行使其功能非常關(guān)鍵。剪切位點(diǎn)一般在U處,具特異性。效應(yīng)階段:RNAi特異性的核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶、解旋酶、輔助識別同源序列蛋白和其他一些蛋白與siRNA結(jié)合成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體RISC(RNAinducingsilencecomplex,RISC)識別靶mRNA,其中的反義鏈與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合,正義鏈則被置換出來。繼而,RISC復(fù)合物中的RNase(可能是Dicer)在靶mRNA與siRNA結(jié)合區(qū)域的中間將其切斷。級聯(lián)放大:在RNA依賴性RNA聚合酶的作
6、用下,以mRNA為模板,siRNA為引物,擴(kuò)增產(chǎn)生足夠數(shù)量的dsRNA作為底物提供給Dicer酶,產(chǎn)生更多的siRNA,從而使效應(yīng)階段反復(fù)發(fā)生,一個完整的mRNA被降解成多個21~23nt的小片段,從而導(dǎo)致相應(yīng)的基因表達(dá)沉默。在這一過程中的多個步驟都需要ATP,如RISC復(fù)合體的形成、siRNA與靶mRNA的配對、靶mRNA的切割。另外,在dsRNA復(fù)制過程中,兩條鏈的分離可能也需要一個依賴ATP的RNA解旋酶。dsRNA可通過細(xì)胞微管在細(xì)胞間傳遞,實(shí)現(xiàn)dsRNA在整個個體中的散布。RNAi在植物、線蟲、果蠅等低等模式生物中,都
7、可由dsRNA誘導(dǎo),在哺乳動物細(xì)胞中,>30bp的dsRNA會引起干擾素效應(yīng)和非特異性基因抑制,導(dǎo)致mRNA非特異性降解,是醫(yī)療上應(yīng)用RNAi的一大障礙,隨后發(fā)現(xiàn)合成雙鏈的只有19~21nt的siRNA卻可以避免這種效應(yīng),特異性發(fā)揮RNAi作用,并發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)入雙鏈RNA(dsRNA)后導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默比用核酶或反義RNA更徹底、更有效。Elbashir等通過瞬時轉(zhuǎn)染體外合成的21nt雙鏈siRNA成功誘導(dǎo)出了哺乳動物細(xì)胞的RNA,i且避免了dsRNA引起的非特異性反應(yīng),這為RNAi技術(shù)在基因治療領(lǐng)域的研究鋪平了道路
8、。3RNAi的作用特點(diǎn)3.1高特異性RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制,有高度的序列特異性,19nt的dsRNA幾乎可以完全抑制基因的表達(dá),而其中的1nt突變后,它對基因的抑制作用就消失了,這種高度的序列特異性能夠使dsRNA非常特異地誘導(dǎo)與之序列同源的m
