畢赤酵母的搖瓶發(fā)酵方法

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1、畢赤酵母的搖瓶發(fā)酵方法：一、搖瓶發(fā)酵方法:畢赤酵母搖瓶發(fā)酵方法分為兩個(gè)階段，1、酵母菌株生長(zhǎng)階段；2、脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)階段。1、酵母生長(zhǎng)階段。準(zhǔn)備試劑：1000mlBMGY培養(yǎng)基，1000mlBMMY培養(yǎng)基，10X的甲醇，搖瓶1L（滅菌），溫控?fù)u床，50ml離心管（滅菌）。紫外分光光度計(jì)，石英比色皿。以下所有操作均在超凈臺(tái)內(nèi)或者無(wú)菌條件下完成。（1）往滅好菌的IL搖瓶中加入100mlBMGY培養(yǎng)基，然后加入約1ml脂肪酶菌株（培養(yǎng)基：菌液=100：1），用透氣膜封口（透氣，但是細(xì)菌不能透過(guò)）。置于溫控?fù)u床上，溫度調(diào)至300C，轉(zhuǎn)速為250-300rpm/min，使

2、酵母生長(zhǎng)，OD600=2.0-6.0，時(shí)間約為15-24小時(shí)。（2）將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入50ml離心管，1500g-3000g離心5min。去掉上清，用BMMY培養(yǎng)基將菌體濃度稀釋至OD600=1.0，約有500ml左右。將稀釋后的發(fā)酵液分別加入到1L的藥瓶中，每個(gè)搖瓶150ml發(fā)酵液（絕不能超過(guò)200ml）。（3）將搖瓶置于溫控?fù)u床上，溫度調(diào)至300C，轉(zhuǎn)速為250-300rpm/min，使酵母表達(dá)脂肪酶，每24小時(shí)加入一次5%的甲醇，使甲醇的終濃度為0.5%。連續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)48小時(shí)。（4）將發(fā)酵液進(jìn)行12000rpm/min離心5min，取上清（若上清仍混濁，可反復(fù)離

3、心）；進(jìn)行酶活分析和蛋白含量分析。BMGY培養(yǎng)基的配制（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（YeastExtract）,加水至700ml；1210C高溫滅菌20min。然后分別在無(wú)菌條件下加入10XYNB100ml，10X磷酸鉀緩沖液（PH6.0）100ml，10X甘油100ml。BMMY培養(yǎng)基的配制方法（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物,加水至700ml；1210C高溫滅菌20min。然后分別在無(wú)菌條件下加入10XYNB100ml，10X磷酸鉀緩沖液（PH6.0）100ml，10X甲醇100ml。1

4、0X的甲醇的配制：取甲醇（AR上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）5ml，加入無(wú)菌水95ml，配置成5%的甲醇溶液，用0.22μM的微孔濾膜（millipore公司）過(guò)濾除菌，該溶液在常溫下的保質(zhì)期為兩個(gè)月。10X的YNB配制方法(1000ml)：稱取YNB（生化試劑，上海生物工程公司，不含硫酸銨）34g,加入100g硫酸銨，待完全溶解后，用0.22μM的微孔濾膜（millipore公司）過(guò)濾除菌。該溶液在常溫下的保質(zhì)期可以達(dá)1年。10X的磷酸緩沖液的配制方法：分別配制1M的K2HPO4和KH2PO4，然后將132ml的K2HPO4和868ml的KH2PO4混合，調(diào)節(jié)PH至6

5、.0；調(diào)PH用磷酸或者KOH，然后1210C高溫滅菌20min。該溶液在常溫下的保質(zhì)期可以達(dá)1年以上。10X的甘油的配制方法（1000ml）：取100ml的甘油加水至1000ml，然后1210C高溫滅菌20min。該溶液在常溫下的保質(zhì)期可以達(dá)1年以上。5．問(wèn)：在下是初學(xué)者，關(guān)于畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)有些問(wèn)題：+E*v1H??}0A$F3s+X????“每24h向培養(yǎng)基中添加100％甲醇至終濃度為0.5～1.0%”這里的甲醇濃度如何控制？4_/z"L!e:j/F4n:}????還有，關(guān)于BMMY的甲醇濃度有些材料里的是0.5%，有的是1.0%，應(yīng)該是哪個(gè)？“每24h向

6、培養(yǎng)基中添加100％甲醇至終濃度為0.5～1.0%”這里的甲醇濃度和BMMY中的甲醇濃度是要一致的嗎？${7J*E3L%b9?/u????另外一個(gè)小問(wèn)題，配10%甘油時(shí)，移入量筒的100%甘油一部分會(huì)粘在管壁上，難免最后配成的10%甘油會(huì)有所偏差，這樣要不要緊？操作上是否有問(wèn)題？+c*h5@5I)]%P"j????參考見解1：,k4N"s*v!x1J:~????“每24h向培養(yǎng)基中添加100％甲醇至終濃度為0.5～1.0%”#%W#B*i3v????我可以給你解釋一下：#q,b'k!c4i0V;h5o*U"F????1、它的意思是每隔24小時(shí)，不斷的添加純甲醇

7、（指的是甲醇試劑含有100％甲醇，不含有其他的成分）至終濃度為0.5～1.0%，指的是添加的甲醇占總體積的0.5～1.0%（即每100升培養(yǎng)基含有甲醇0.5～1.0升，如果是質(zhì)量體積比則是每100毫升培養(yǎng)基含有甲醇0.5～1.0克）$M;f0d&]+I,`'R%J4p????2、只要你添加的量在以上的這個(gè)范圍就可以，當(dāng)然可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，但是一般要在此范圍內(nèi)。&m9~5k&c&b*@8w????3、配10%甘油時(shí)，注意先加入部分水后在稱取甘油加入，然后在定容到所需要的體積，這樣就可以避免甘油粘在管壁上，甘油易溶于水，配好后，再粘在管壁上就不會(huì)影響了

8、。!O._(q(G*o1