定向改造釀酒酵母積累丙酮酸的研究 學位論文 .doc

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1、天津科技大學研究生學位論文(申請碩士學位)定向改造釀酒酵母積累丙酮酸的研究STUDYONDIRECTELYTANSFORMSACCHAROMYCESCEREVISIAEFORACCUMULATEPYRUVICACID專業(yè)名稱：發(fā)酵工程指導教師：高年發(fā)教授研究生姓名：鄧旭衡申請學位級別：工學碩士論文提交日期：2011年1月分類號：Q751學校代碼：10057密級：（秘密、機密、絕密）研究生學號：08809005定向改造釀酒酵母積累丙酮酸的研究StudyonDirectlyTransformSaccharomycesCerevisiaeforAccumulat

2、ePyruvicAcid專業(yè)名稱：發(fā)酵工程指導教師姓名：高年發(fā)教授研究生姓名：鄧旭衡申請學位級別：工學碩士論文提交日期：2011年1月論文課題來源：自選學位授予單位：天津科技大學天津科技大學學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導師的指導下獨立進行研究工作所取得的成果。除文中特別加以標注引用的內(nèi)容外，本論文不包括任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果內(nèi)容，也不包括為獲得天津科技大學或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。對本文研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔。作者簽名：日期：年

3、月日知識產(chǎn)權(quán)和專利權(quán)保護聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導師具體指導下并得到相關(guān)研究經(jīng)費支持下完成的，其數(shù)據(jù)和研究成果歸屬于導師和作者本人，知識產(chǎn)權(quán)單位屬天津科技大學；所涉及的創(chuàng)造性發(fā)明的專利權(quán)及使用權(quán)完全歸天津科技大學所有。本人保證畢業(yè)后，以本論文數(shù)據(jù)和資料發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名第一單位仍然為天津科技大學。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔。作者簽名：日期：年月日學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解學校有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，同意公布論文的全部或部分內(nèi)容，允許

4、論文被查閱和借閱。本人授權(quán)天津科技大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學位論文。保密（請在方框內(nèi)打“√”），在年解密后適用本授權(quán)書。本學位論文屬于不保密（請在方框內(nèi)打“√”）。作者簽名：日期：年月日導師簽名：日期：年月日摘要丙酮酸是一種重要的有機酸，它廣泛地應(yīng)用于化工原料、藥物及農(nóng)用化學試劑的生產(chǎn)和研究中。目前生產(chǎn)丙酮酸的方法主要有化學合成法、生物催化法和生物發(fā)酵法?；瘜W合成法、酶催化法合成具有原料難得、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成本較高，不適于大規(guī)模生產(chǎn)，而且合成的丙酮酸酸多為外消旋混合物等缺點，因此

5、利用微生物法合成丙酮酸酸成為發(fā)展趨勢。發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的主要研究思路和目標是：（1）減少丙酮酸的進一步降解及轉(zhuǎn)化；（2）加快發(fā)酵底物葡萄糖的酵解速度，提高生產(chǎn)強度。釀酒酵母作為一種研究和應(yīng)用最為廣泛的真核微生物，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇具有極好的優(yōu)勢。在厭氧條件和溢出代謝情況下，經(jīng)糖酵解生成的丙酮酸幾乎全部或大部分流向生產(chǎn)乙醇的支路，從而產(chǎn)生乙醇的積累；同時酵母細胞具有較高的耐受性，可以積累較高濃度的乙醇。通過合理利用產(chǎn)乙醇的代謝流向，將乙醇的代謝流引向丙酮酸的積累，為丙酮酸的生產(chǎn)提供了新的思路。本論文就是研究定向阻斷釀酒酵母丙酮酸的進一步代謝，從而積累丙酮酸。以菌株

6、S.cerevisiaeY2為出發(fā)菌株，把pdc1基因敲除片段用電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到出發(fā)菌株S.cerevisiaeY2中，在含G418抗性的YEPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子，通過PCR驗證得到pdc1基因的敲除菌株S.cerevisiaeY21△。然后把pdc5基因敲除菌株敲除片段用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到S.cerevisiaeY21△中，在YNBG平板上篩選轉(zhuǎn)化子，通過PCR驗證得到pdc1和pdc5基因都缺失的菌株S.cerevisiaeY21△5△。然后用southernblot進一步驗證S.cerevisiaeY2pdc1和pdc5基因的缺失。為比較丙酮酸脫羧

7、酶基因敲除后酶活的變化，分別測定S.cerevisiaeY2，S.cerevisiaeY21△和S.cerevisiaeY21△5△的丙酮酸脫羧酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S.cerevisiaeY21△和S.cerevisiaeY21△5△的丙酮酸脫羧酶的活性較S.cerevisiaeY2分別減少了31%和98%。對基因敲除菌株和出發(fā)菌株進行簡單發(fā)酵實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙酮酸的產(chǎn)量有顯著提高，S.cerevisiaeY2，S.cerevisiaeY21△和S.cerevisiaeY21△5△的發(fā)酵120h的丙酮酸產(chǎn)量分別為1.24g/L、2.894g/L、9.264g/

8、L。為進一步提高S.cerevisiaeY21△5△的丙酮酸產(chǎn)量，