土壤淀粉酶產(chǎn)生菌的分離純化及相關(guān)性質(zhì)測(cè)定

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1、土壤淀粉酶產(chǎn)生菌的分離純化及相關(guān)性質(zhì)測(cè)定摘要:為了了解土壤中微生物的種類和特征并從中分離出淀粉酶產(chǎn)生菌,對(duì)其進(jìn)行純化和培養(yǎng),并測(cè)定其產(chǎn)生的淀粉酶的活性以及對(duì)其進(jìn)行生理生化試驗(yàn),了解其代謝特征,需要進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn),并在此過(guò)程中掌握分離純化微生物、微生物液體培養(yǎng)法、透明圈法測(cè)定淀粉酶活力以及生理生化試驗(yàn)的操作方法和原理。主要實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下:從土壤中篩選淀粉酶產(chǎn)生菌后進(jìn)行復(fù)篩,接著進(jìn)行種子培養(yǎng),所得發(fā)酵液用于淀粉酶活力的測(cè)定以及生理生化反應(yīng)。關(guān)鍵詞:土壤淀粉酶產(chǎn)生菌分離純化發(fā)酵培養(yǎng)透明圈法生理生化試驗(yàn)正文:1、土壤淀粉酶產(chǎn)生菌的分離與純化1.1實(shí)驗(yàn)原理在自然條件下,微

2、生物常常在各種生態(tài)系統(tǒng)中群居雜聚。為了研究某種微生物的特性,或者大量培養(yǎng)和利用某一種微生物,必須事先從有關(guān)的生態(tài)環(huán)境中分離出所需的菌株,獲得純培養(yǎng)。獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的純種分離法,也即是從含有多種雜居在一起的微生物材料中,通過(guò)稀釋分離、劃線分離、單孢子分離等方法,使它們分離成為單個(gè)個(gè)體并在固定培養(yǎng)基的固定地方繁殖成為單個(gè)菌落,從單個(gè)菌落中挑選所需純種。不同微生物可用不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)條件進(jìn)行單菌分離獲得純種,純種再經(jīng)繁殖培養(yǎng)后,可用于進(jìn)一步研究形態(tài)、生理等欲從含有多種微生物的樣品中直接辨認(rèn)出,并且取得某種所需微生物的個(gè)體進(jìn)行純培養(yǎng),那是困難的。由于微生

3、物可以形成菌落,而每個(gè)單一菌落常常是由一種個(gè)體繁殖而成。不同微生物的菌落是可以識(shí)別和加以鑒定的。因此將樣品中不同微生物個(gè)體在特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)出不同的單一菌落,再?gòu)倪x定的某一所需菌落中取樣,移植到新的培養(yǎng)基中去,就可以達(dá)到分離純種的目的。這就是純種分離法的原理。在微生物的分離和純種培養(yǎng)過(guò)程中,必須使用無(wú)菌操作技術(shù)。所謂無(wú)菌操作,就是在分離、接種、移植等各個(gè)操作環(huán)節(jié)中,必須保證在操作過(guò)程中杜絕外界環(huán)境中的雜菌進(jìn)入培養(yǎng)的容器。淀粉是有葡萄糖通過(guò)α-1,4糖苷鍵構(gòu)成的直鏈淀粉和α-1,6位有分支的直鏈淀粉組成的。按照水解方式的不同,主要的淀粉酶可以分為α-淀粉酶、β-

4、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶4大類。產(chǎn)淀粉酶的微生物有細(xì)菌、霉菌和酵母等。利用淀粉遇碘變?yōu)樗{(lán)色的特性,將分離的微生物接種在含有淀粉的固體培養(yǎng)基表面進(jìn)行培養(yǎng),利用滴加碘液后菌落周?chē)霈F(xiàn)透明圈,未水解的淀粉呈藍(lán)色,水解圈無(wú)色,判斷是否產(chǎn)生淀粉酶及初步判斷淀粉酶活力的高低。從微生物群體中經(jīng)分離、生長(zhǎng),在平板上形成的肉眼可見(jiàn)的菌落,不一定是單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而成的,有的可能來(lái)自2個(gè)或者多個(gè)細(xì)胞。因此,純培養(yǎng)的確定觀察菌落特征外,還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征等綜合考慮。甚至有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列的分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定方能得到。1.2實(shí)驗(yàn)器材1.2.1材料

5、土壤樣品、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、99ml無(wú)菌水1瓶(帶玻璃珠)、5支9ml無(wú)菌水/試管等。1.2.2用具無(wú)菌培養(yǎng)基、無(wú)菌吸管、無(wú)菌水、酒精燈、無(wú)菌涂布棒(又名擴(kuò)散棒、三角棒)、接種環(huán)、生物潔凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、人工智能培養(yǎng)箱、手動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器(SC6)、移液器、移液槍、試管、三角瓶、顯微鏡等。1.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程1.3.1土壤稀釋液的制備稱取土壤,制備稀釋度分別為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀釋液。1.3.2稀釋平板法從土樣中分離真菌先在無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入稀釋度為10-7的土壤稀釋液0.2mL,再加入馬鈴薯培養(yǎng)基,充分混勻

6、鋪平并凝固后倒置于28~30℃恒溫培養(yǎng)5~6d,培養(yǎng)完成后觀察真菌菌落形態(tài)。結(jié)果如圖1所示,培養(yǎng)基上分布有多個(gè)菌落,根據(jù)顏色判斷為有兩種真菌,一種正面為青色,背面為肉色,有9個(gè)菌落,另一種正面為墨綠色,背面為黑色,有霉味,有3個(gè)菌落。圖1稀釋平板法分離真菌結(jié)果1.3.3平板涂抹法分離土壤中的放線菌先在無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入適量淀粉培養(yǎng)基,鋪成平板,凝固后,再加入稀釋度為10-7的土壤稀釋液0.2mL,用無(wú)菌三角玻棒在平板表面涂抹均勻,倒置于28~30℃條件下培養(yǎng)3~4d,觀察放線菌菌落形態(tài)。結(jié)果如圖2所示,并沒(méi)有分離得到單菌落,而只有菌苔,顏色為黃色,有泥腥味。沒(méi)有出

7、現(xiàn)單菌落可能是操作出現(xiàn)差錯(cuò),因?yàn)橄♂尪葹?0-7,并沒(méi)有偏大,所以可能是操作的問(wèn)題。圖2平板涂抹法分離放線菌結(jié)果1.3.4平板劃線法分離土壤中的細(xì)菌先在無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,制成平板,再用分區(qū)劃線法挑取稀釋度為10-2的土壤稀釋液一環(huán)在平板上劃線。劃線完畢,蓋上皿蓋,倒置于28~30℃培養(yǎng)。觀察細(xì)菌菌落形態(tài),結(jié)果如圖3所示,有肉眼可見(jiàn)的單菌落,直徑約為3mm,顏色為肉色,有臭味。圖3平板劃線法分離細(xì)菌結(jié)果1.3.5用劃線分離法對(duì)淀粉酶產(chǎn)生菌進(jìn)行分離純化1.3.5.1在分離出真菌的馬鈴薯培養(yǎng)基的平板上滴加碘液,如圖4所示,可以看出僅有一個(gè)菌落的水解圈

8、較大符合要求,挑取該菌落

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