光 合 關(guān) 鍵 酶 的 測(cè) 定 方 法

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1、光合關(guān)鍵酶的測(cè)定方法一、酶液的制備取植物樣品0.5g左右放入用液氮預(yù)冷的研缽中，迅速研磨成粉末狀，加入3.0ml（w/v為1：6）預(yù)冷的100mMTris-H2SO4提取緩沖液【PH8.2，內(nèi)含7.0mM巰基乙醇，1.0mMEDTA-Na（乙二胺四乙酸鈉鹽），5%甘油和1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）】，混勻后在4℃下反應(yīng)20min，混合液于4℃下15000r/min離心15min，取上清液備用。二、RUBPC活性的測(cè)定方法（參照Racker方法并略加改動(dòng)）反應(yīng)混合液（總體積3.2ml）組成：0.1MTris-HCl緩沖液(pH8.0)、0.1MMgCl2、50m

2、M腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、50mM二硫蘇糖醇（DTT）、2.0mMNADH、1.0mMEDTA-Na各0.3ml，200μMNaHCO30.1ml，蒸餾水1.0ml，3-磷酸甘油酸激酶（PGK）/3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAP-DH）（15u/15u）0.1ml，酶提取液0.1ml，30℃恒溫水浴預(yù)溫10min，將反應(yīng)體系搖勻倒入比色杯內(nèi)，以蒸餾水為空白，于340nm下測(cè)吸光度值E0，最后加入9.0mM1，5-二磷酸核酮糖（RuBP）0.1ml啟動(dòng)反應(yīng)，立刻每隔10～15s間隔測(cè)定光吸收的變化。三、PEPC活性的測(cè)定方法（施教耐等方法）反應(yīng)液總體積3.1ml

3、，內(nèi)含1.0ml0.1MTris-H2SO4(pH9.2)，1.0ml酶提取緩沖液，0.1ml10mMMgCl2，0.1ml10mMNaHCO3，0.2ml40mM磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），0.3ml1.0mg/mlNADH，過量的蘋果酸脫氫酶（MDH，約10.5U）0.2ml，于28℃水浴預(yù)溫10min，用0.2mlPEPC提取液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，迅速在340nm下測(cè)吸光度的下降。RuBPCasereactionmedium1.0.1MTris-HCl(pH8.0)2.0.1MMgCl23.50mMATP4.50mMDTT各0.3ml5.2mMNADH6.1mME

4、DTA7.200μMNaHCO30.1ml8.PGK/GAP-DH（15U/15U）0.1ml9.9mMRuBP0.1ml10.酶提取液0.1ml11.蒸餾水1.0ml總體積3.2mlPEPCasereactionmedium1.0.1MTris-H2SO4(pH9.2)1.0ml2.酶提取緩沖液1.0ml3.10mMMgCl20.1ml4.10mMNaHCO30.1ml5.40mMPEP0.2ml6.1mg/mlNADH0.3ml7.過量的MDH（約10.5U）0.2ml8.酶提取液0.2ml總體積3.1ml酶活性測(cè)定反應(yīng)液組成：注：參考文獻(xiàn)――董永華等，A

5、BA和6-BA對(duì)水分脅迫下玉米幼苗碳素同化關(guān)鍵酶的影響。植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，1997，3（2）：182－187.四、RUBPC和PEPC活性測(cè)定操作步驟操作流程如下：準(zhǔn)確稱取0.5g±植物樣品，剪碎放入預(yù)冷研缽中加入液氮，迅速研磨加入3.0ml提取緩沖液，4℃下反應(yīng)20min溶液在4℃下15000r/min離心15分鐘PEPC測(cè)定RUBPC測(cè)定上清液即為粗酶液，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?℃）RUBPC反應(yīng)液2.9mlPGK/GAP-DH0.1ml(15U/15U)酶提取液0.1ml蛋白測(cè)定PEPC反應(yīng)液2.5mlPEP0.2mlMDH（約10.5U）0.2ml取0.1

6、ml粗酶液加5.0ml考馬斯亮蘭染色劑，混勻放置2.0min，于595nm比色30℃水浴10min340nm測(cè)光密度E028℃水浴10min加酶提取液0.2ml啟動(dòng)反應(yīng)，迅速在340nm測(cè)吸光度的下降（3min）加RUBP0.1ml啟動(dòng)反應(yīng)，迅速檢測(cè)吸光度的減少（1min）說明：1.RUBPC反應(yīng)液（2.9ml）包括：0.1MTris-HCl(pH8.0)、0.1MMgCl2、50mMATP、50mMDTT、2.0mMNADH、1.0mMEDTA-Na各0.3ml，200μMNaHCO30.1ml，蒸餾水1.0ml。2.PEPC反應(yīng)液（2.5ml）包括：1.0

7、ml0.1MTris-H2SO4(pH9.2)，1.0ml酶提取緩沖液，0.1ml10mMMgCl2，0.1ml10mMNaHCO3，0.3ml1.0mg/mlNADH。3.上述兩種反應(yīng)液的配制方法是：先按要求的濃度配制各組分試劑溶液，然后根據(jù)各試劑的體積按比例混合而成。4.為減小實(shí)驗(yàn)誤差，粗酶液提取出來后，應(yīng)先測(cè)RUBPC活性，其次測(cè)PEPC活性，最后測(cè)定可溶性蛋白含量?？扇苄缘鞍椎臏y(cè)定反應(yīng)液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇(用無水乙醇加水兌成)中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，過濾。(配制時(shí)要避光)(1000ml反應(yīng)液可做33

8、0個(gè)樣品)測(cè)定：20ūl酶液+3mlG