一株雞源性乳酸桿菌的分離鑒定及特性研究(飼料研究) - 副本.

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1、一株雞源性乳酸桿菌的分離鑒定及特性研究張飛燕1張根偉1張麗萍11河北省科學(xué)院生物研究所石家莊050081摘要：文章旨在篩選用于研制益生菌制劑的優(yōu)良乳酸菌菌株。筆者從嶂石巖山區(qū)散養(yǎng)雞的雞糞中，經(jīng)初篩、復(fù)篩分離到1株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有強頡頏作用的產(chǎn)酸菌，編號為R-8，經(jīng)形態(tài)及生理生化試驗初步判定為乳酸桿菌，再結(jié)合16SrDNA分子鑒定，進一步確定為植物乳桿菌。該菌株可以利用葡萄糖、乳糖、蔗糖等多種碳源，平板擴散抑菌試驗結(jié)果得出，對大腸桿菌的抑菌圈直徑達16.0mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達16.5mm，且在PH為2.

2、0時，存活率達到86.4%，在膽鹽濃度3%時，存活率為53.7%，具有用于研制益生菌制劑的潛力。關(guān)鍵詞：益生菌，分離鑒定，16SrDNA益生菌制劑是近年來國內(nèi)外迅速崛起的飼料添加劑，其作用可以維持腸道內(nèi)菌群平衡、促進動物生長和提高機體免疫力等，還能夠解決飼用抗生素產(chǎn)生的耐藥性，藥物殘留等問題，已被廣泛應(yīng)用于畜牧和飼料領(lǐng)域。益生菌制劑的制備需要益生菌，而產(chǎn)乳酸的乳酸桿菌因能維持雞腸道微生物區(qū)系平衡和消化機能，抑制腐敗菌，改善肝功能，安全、優(yōu)質(zhì)、高效等優(yōu)點成為最理想的益生菌之一。本文從雞糞便中分離篩選鑒定出了1株頡頏性強的植物乳桿菌，

3、并對其生理生化特性及耐受特性進行了研究，以期為乳酸桿菌益生菌制劑將來的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1菌種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌兩種病原指示菌均由河北省科學(xué)院生物研究所提供。1.1.2培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氫二鉀2g/L，碳酸鈣20g/L，牛肉膏10g/L，乙酸鈉5g/L，硫酸鎂0.02g/L，吐溫801ml，酵母膏5g/L，檸檬酸二銨2g/L，硫酸錳0.05g/L。PH6.8-7.0。1.2方法1.2.1菌株的分離取從山區(qū)采集回的散養(yǎng)雞的雞糞10g，用水浴鍋水浴，條件

4、為80℃，30min。采用傾注法按10倍稀釋法制成不同濃度的雞糞稀釋液，取3個合適的稀釋濃度分別吸取100ul加入無菌平皿中，做3個平行，將先前融化并冷卻至50℃左右的MRS培養(yǎng)基，向每個平皿中傾倒約10ml，迅速使其混合均勻，凝固后37℃倒置培養(yǎng)48h。挑取有溶鈣圈（產(chǎn)酸）的菌落，“Z”形反復(fù)劃線分離至純菌株。1.2.2對峙培養(yǎng)法初篩取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌這兩種病原指示菌分別涂布于MRS培養(yǎng)基平板上，將前期分離保存的產(chǎn)酸菌，穿刺到此兩種MRS培養(yǎng)基平板上，37℃進行對峙培養(yǎng)24h，測定抑菌圈的大小。1.2.3平板擴散法復(fù)篩將

5、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌兩種病原指示菌分別接種到普通肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h，配制成106cfu/ml的菌液作為指示菌液。將初篩試驗中抑菌效果明顯的菌株置于盛有MRS液體培養(yǎng)基的厭氧管中，37℃、48h培養(yǎng)3代，將第3代液體培養(yǎng)物離心取上清，過濾除菌，繼而用直徑為1cm的打孔器在表面涂有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MRS培養(yǎng)基平皿上等距離打三個孔，每孔點樣100μL，同時設(shè)用0.2mol/LNaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液為pH6.5抑菌試驗對照，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，測量抑菌圈直徑。1.2.4形態(tài)及生理和生化鑒定對復(fù)篩菌株進行顯微鏡觀察

6、，并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對復(fù)篩的菌株進行生理生化鑒定。1.2.5對酸的耐受試驗取復(fù)篩菌株發(fā)酵24h的菌液10mL，3000r/min離心15min，倒掉上清，用生理鹽水將離心后的菌體洗3次，再將復(fù)篩菌株的菌懸液用10mol/L的Hcl調(diào)至pH值分別為2.0、3.0和4.0，最后用生理鹽水定容至10mL，放在37℃培養(yǎng)箱恒溫處理2h。將2h后的菌懸液，做稀釋平皿活菌計數(shù)，從而計算出菌株的存活率，以pH5.5～6.5的菌液為空白對照。存活率=待測PH的菌液活菌數(shù)/pH5.5～6.0的菌液活菌數(shù)×100%。

7、1.2.6對膽鹽的耐受試驗菌液按5%(v/v)的量接種于膽鹽濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%(w/v)的MRS培養(yǎng)基中，以不加膽鹽的MRS培養(yǎng)基為對照，37℃培養(yǎng)30min，取樣進行平板菌落計數(shù)，計算乳酸菌存活率。1.2.716SrRNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)造（1）PCR產(chǎn)物測序擴增16SrRNA序列的上行引物為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下行引物為：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。對菌株R-8進行16SrDNA的PCR擴增。將得到的PCR產(chǎn)物送北京生工生物技術(shù)有

8、限公司進行測序。在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行相似序列比對,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析菌種同源性。（2）系統(tǒng)發(fā)育分析采用DNA-MAN、DNAclub、MEGA4等軟件對菌株R-8的16SrDNA序列進行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。1.8　數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析