實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)

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1、簡(jiǎn)述實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)結(jié)合了實(shí)時(shí)定量PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量試劑、通用電腦和自動(dòng)分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)。實(shí)時(shí)PCR的設(shè)想是由Higuchi于1992年最早提出[1]。熒光探針技術(shù)是根據(jù)標(biāo)記基團(tuán)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET)原理而實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)

2、射光譜與另一個(gè)熒光基團(tuán)的吸收光譜重疊，且2個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長(zhǎng)(高能量)的熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)(低能量)的熒光基團(tuán)，相當(dāng)于短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)釋放的熒光被屏蔽，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為FRET。定量原理：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度成線(xiàn)性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線(xiàn)。理想的擴(kuò)增曲線(xiàn)應(yīng)為J型，符合2N方程(其中N為PCR的循環(huán)次數(shù))，但實(shí)際上擴(kuò)增曲線(xiàn)為S型。在PCR反應(yīng)早期，不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線(xiàn)性期和最終的平臺(tái)期，因此可以在指數(shù)期的某一點(diǎn)上檢測(cè)PCR產(chǎn)物

3、的量，并由此推斷起始模板含量[2-3]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖1。其中Rn+表示每點(diǎn)測(cè)量的熒光強(qiáng)度，代表反應(yīng)管含有模板DNA；Rn-表示熒光基線(xiàn)強(qiáng)度，代表反應(yīng)管不含有模板DNA，其在理想情況下是一條平線(xiàn)，只具有背景熒光數(shù)值；△Rn的值表示PCR過(guò)程中，探針降解的量，也即PCR產(chǎn)物的量?；€(xiàn)(baseline)是背景曲線(xiàn)的一段，范圍為從反應(yīng)開(kāi)始不久熒光值開(kāi)始變得穩(wěn)定，到所有反應(yīng)管的熒光都將要但是還未超出背景。圖1實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線(xiàn)熒光閾值(threshold)是以PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)(b

4、aseline)，熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，即：Threshold=10SD(cycle3-15)，一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測(cè)出的熒光信號(hào)是一個(gè)可信的信號(hào)，可以用于定義一個(gè)樣本的Ct值。Ct值也稱(chēng)閾值循環(huán)(thresholdcycle)，指在PCR循環(huán)過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，也就是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究結(jié)果表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品可作出標(biāo)

5、準(zhǔn)曲線(xiàn)，因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理就是樣本核酸擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)，在反應(yīng)體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA含量與擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)數(shù)成正比，由于反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標(biāo)記物(熒光探針)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，因此通過(guò)熒光量的檢測(cè)就可以測(cè)定樣本核酸量。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的類(lèi)型及特點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的常用機(jī)制包括熒光染料檢測(cè)和水解探針檢測(cè)。2.1SYBRGreenI檢測(cè)SYBRGreenI是一種能結(jié)合到dsDNA小溝部位的具

6、有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料，它只有與dsDNA結(jié)合后才會(huì)發(fā)出熒光。在變性時(shí)，DNA雙鏈分開(kāi)，不產(chǎn)生熒光；在復(fù)性和延伸時(shí)，形成dsDNA，SYBRGreenI發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，直到達(dá)到閾值，被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到[4]。因此，熒光強(qiáng)度可以代表擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。SYBRGreenI的優(yōu)點(diǎn)在于：①成本較低，不需合成和標(biāo)記探針；②適合初步篩查：選用SYBR篩查，再用探針?lè)ň_定量少數(shù)關(guān)鍵樣品。但其缺點(diǎn)有：①特異性差，不能分辨主帶與雜帶，給出的是總信號(hào)，所以在低樣本濃度時(shí)，不能進(jìn)行基因突變分析。但該方法可利用熔點(diǎn)曲線(xiàn)分析將特異產(chǎn)物、引物二聚體和非特異

7、性產(chǎn)物區(qū)別開(kāi)來(lái)，不需要通過(guò)電泳鑒定；②不能做多重檢測(cè)，每孔只能檢測(cè)1個(gè)目標(biāo)基因；③靈敏度低，適合于5000拷貝以上的基因定量。2.2TaqMan探針PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。圖2

8、常規(guī)TaqMan探針檢測(cè)原理常規(guī)TaqMan探針的5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)。該探針在PCR過(guò)程中不