熒光pcr原理、常用探針的優(yōu)缺點(diǎn)及多重?zé)晒鈖cr技術(shù)進(jìn)展

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1、闡述熒光PCR原理、常用探針的優(yōu)缺點(diǎn)及多重?zé)晒釶CR技術(shù)進(jìn)展摘要：熒光PCR技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的一種新型核酸定量技術(shù)。該技術(shù)具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、快速、靈敏、精確等特點(diǎn),是對(duì)原有PCR技術(shù)的革新,擴(kuò)大了PCR的應(yīng)用范圍。本文綜述了熒光PCR技術(shù)的原理、常用探針的原理和優(yōu)缺點(diǎn)，PCR技術(shù)的研究方向及其應(yīng)用。關(guān)鍵詞：熒光PCR;探針;多重?zé)晒釶CR;應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR是一種體外擴(kuò)增DNA片斷的技術(shù)，根據(jù)擴(kuò)增策略和檢測(cè)產(chǎn)物手段的不同，可分為定性PCR和定量PCR。實(shí)時(shí)PCR(rea-ltimequantitativepolymerasechainreaction,

2、RQ-PCR)又稱熒光定量PCR,是由美國(guó)AppliedBisystems公司于1996年研制出的一種新型核酸定量技術(shù),并隨著熒光PCR儀的推出而逐漸得到廣泛應(yīng)用[1]。該技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技術(shù),加入熒光標(biāo)記探針,巧妙地把核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合在一起,在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量,并據(jù)此推斷目的基因的初始量[2]。1.熒光PCR的原理熒光PCR技術(shù)是指在普通PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積

3、累監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量的方法。熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，添加了一條標(biāo)記了兩個(gè)熒光基團(tuán)的探針。一個(gè)標(biāo)記在探針的5’端，稱為熒光報(bào)告基團(tuán)(R);另一個(gè)標(biāo)記在探針的3’端，稱為熒光抑制基團(tuán)(Q)。兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即5’端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被3’端的熒光抑制基團(tuán)吸收或抑制。當(dāng)二者距離較遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用消失，報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)增強(qiáng)[3]。熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物同比增長(zhǎng)，隨PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)。熒光PCR方法就是利用此原理，在PCR反應(yīng)過(guò)程中，連續(xù)不斷地檢測(cè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化。當(dāng)信號(hào)增強(qiáng)到某一閩值(PCR反應(yīng)的前幾個(gè)循環(huán)

4、的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閉值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍)時(shí)，此時(shí)的循環(huán)次數(shù)(Ct值)就被記錄下來(lái)，如圖1-1所示。該循環(huán)參數(shù)(Ct值)和PCR反應(yīng)體系中起始模板量的對(duì)數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖1-2所示，再根據(jù)樣品的Ct值就可以準(zhǔn)確確定起始模板的數(shù)量。2.探針的介紹2.1分子信標(biāo)探針Tyagi和槍ammer(1996)首次建立了分子信標(biāo)探針[4]，在同一寡核苷酸探針的5’端標(biāo)記熒光素、3’端標(biāo)記淬滅劑(DABCYL)、、其工作原理如圖1-3所示。分子信標(biāo)探針能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針的樸琳環(huán)與目的DN

5、A堿基互補(bǔ)，樸琳環(huán)兩側(cè)為與目的DNA無(wú)關(guān)的堿基互補(bǔ)的臂。無(wú)目的DNA時(shí)，探針形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光素靠近淬滅劑，熒光素接受的能量通過(guò)共振能量轉(zhuǎn)移至淬滅劑，DABCYL吸收能量后以熱量形式散失，結(jié)果不產(chǎn)生熒光。當(dāng)探針遇到目的DNA分子時(shí)，形成一個(gè)比兩臂雜交更長(zhǎng)也更穩(wěn)定的雜交，探針自發(fā)進(jìn)行構(gòu)型變化，使兩臂分開(kāi)，熒光素和淬滅劑隨之分開(kāi)，此時(shí)在紫外照射下，熒光素產(chǎn)生熒光。影響分子信標(biāo)探針構(gòu)型變化的參數(shù)主要有:臂長(zhǎng)、臂序列GC含量、樸琳環(huán)長(zhǎng)度和溶液鹽濃度，尤其是二價(jià)陽(yáng)離子如Mg2+對(duì)兩臂形成的環(huán)有較強(qiáng)的穩(wěn)定作用，在M存在條件下，4-12個(gè)核苷酸可形成穩(wěn)定的雜交莖。樸琳環(huán)長(zhǎng)度至少應(yīng)是臂長(zhǎng)

6、的2倍，才能保證探針與目標(biāo)DNA雜交及熒光素與淬滅劑分離。分子信標(biāo)為熒光淬滅探針，空間上呈發(fā)夾狀，其環(huán)狀部分與靶序列互補(bǔ)，位于莖干部分的5’和3’端分別標(biāo)記一個(gè)熒光分子和淬滅分子。在PCR反應(yīng)中分子信標(biāo)與靶序列雜交，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)而發(fā)出熒光。分子信標(biāo)的特殊發(fā)夾結(jié)構(gòu)使之具有高度的雜交特異性，能檢測(cè)單堿基突變。在PCR產(chǎn)物測(cè)定、遺傳分型、藥物篩選、突變分析、RNA測(cè)定[5]等領(lǐng)域正得到迅速應(yīng)用。2.2TaqMan探針TaqMan探針(亦稱水解探針)是一段5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)(用R表示)，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)(用Q表示)的寡核營(yíng)酸。報(bào)告熒光基團(tuán)如FAM共價(jià)結(jié)合到寡核苷酸的5’

7、端[6]。TET、vlc、JoE及HEx也常用作報(bào)告熒光基團(tuán)。所有這些報(bào)告熒光基團(tuán)通常都由位于3’端的淬滅熒光基團(tuán)TAMRA所淬滅。TaqMan探針的工作原理如圖1-4所示，當(dāng)PCR反應(yīng)在退火階段時(shí)，一對(duì)引物和一條探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上R基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào):當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，以四種脫氧核昔酸為底物，根據(jù)堿基配對(duì)原則，沿著模板鏈合成新鏈，當(dāng)鏈的延伸進(jìn)行到探針結(jié)合部位時(shí)，受到探針的阻礙而無(wú)法繼續(xù)，此時(shí)Taq酶發(fā)揮它的5’-3’外切核酸酶的功能