分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用

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1、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)課程論文學(xué)院：班級(jí)：姓名：學(xué)號(hào)：課程論文題目：分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用課程名稱(chēng)：分子生物學(xué)評(píng)閱成績(jī)：評(píng)閱意見(jiàn)：成績(jī)?cè)u(píng)定教師簽名：日期：年月日分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用學(xué)生：劉結(jié)卯（動(dòng)科院09級(jí)畜牧班學(xué)號(hào)：200940511227）摘要：自20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展，產(chǎn)生了另一類(lèi)重要的遺傳標(biāo)記，即以直接檢測(cè)DNA分子堿基序列變異=為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的可遺傳變異都是由于DNA序列變異而照成的，其變已有單堿基和多堿基突變（包括DNA重排、堿基替換、插入、缺失、異位、倒位等）

2、和重復(fù)序列引起的變異。關(guān)鍵詞：基因、分子標(biāo)記DNA、遺傳、變異、應(yīng)用、鑒定、定位一、什么是分子標(biāo)記技分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映DNA分子標(biāo)記具有的優(yōu)越性有：大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對(duì)隱性的性狀的選擇十分便 利；基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無(wú)限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；分子標(biāo)記揭示來(lái)自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無(wú)連鎖；檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、迅速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種

3、，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆等方面。廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義分子標(biāo)記是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。理想的分子標(biāo)記必須達(dá)以下幾個(gè)要求：具有高的多態(tài)性；共顯性遺傳，即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；能明確辨別等位基因；遍布整個(gè)基因組；除特殊位點(diǎn)的標(biāo)記外，要求分子標(biāo)記均勻分布于整個(gè)基因組；選擇中性(即無(wú)基因多效性；檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速(如實(shí)驗(yàn)程序易自動(dòng)化)；開(kāi)發(fā)成本和使用成本盡量低廉；在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性

4、好（便于數(shù)據(jù)交換) 但是，目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標(biāo)記均不能滿足以所有要求。一、分子標(biāo)記技術(shù)的分類(lèi)（一）、基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)此類(lèi)標(biāo)記技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶解及凝膠電泳分離不同的生物DNA分子，然后用經(jīng)標(biāo)記的特異DNA探針與之進(jìn)行雜交，通過(guò)放射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來(lái)揭示DNA的多態(tài)性。?。ǘ┗赑CR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)（1）隨機(jī)引物的PCR標(biāo)記所用引物的核苷酸序列是隨機(jī)的，其擴(kuò)增的DNA區(qū)域事先未知。隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增的DNA區(qū)段產(chǎn)生多態(tài)性的分子基礎(chǔ)是模板DNA擴(kuò)增區(qū)段上引物結(jié)合位點(diǎn)的堿基序列的突變，不同來(lái)源的基因組在該

5、區(qū)段上表現(xiàn)為擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)差異或擴(kuò)增片段大小的差異。隨機(jī)引物PCR標(biāo)記表現(xiàn)為顯性或共顯性。（2）、特異引物的PCR標(biāo)記　特異引物的PCR標(biāo)記所用引物是針對(duì)已知序列的DNA區(qū)段而設(shè)計(jì)的，具有特定核苷酸序列（通常為18—24bp），可在常規(guī)PCR復(fù)性溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)基因組DNA的特定區(qū)域進(jìn)行多態(tài)性分析。（三）基于限制性酶切和PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記?。?）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP)　AFLP是1993年荷蘭科學(xué)家Zbaeau和Vos發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的新

6、方法。AFLP是RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其基本原理是先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組DNA產(chǎn)生不同大小的DNA片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板DNA，然后以人工接頭的互補(bǔ)鏈為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，最后在接頭互補(bǔ)鏈的基礎(chǔ)上添加1—3個(gè)選擇性核苷酸作引物對(duì)模板DNA基因再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè)獲得的DNA擴(kuò)增片段，根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的不同檢測(cè)出多態(tài)性。引物由三部分組成：與人工接頭互心堿基序列、限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列、引物3 ’端的選擇堿基序列（1—10bp）。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個(gè)堿基序列

7、為結(jié)合位點(diǎn)。該技術(shù)的獨(dú)特之處在于所用的專(zhuān)用引物可在知道DNA信息的前提下就可對(duì)酶切片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為使酶切濃度大小分布均勻，一般采用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶，一 個(gè)酶為多切點(diǎn)，另一個(gè)酶切點(diǎn)數(shù)較少，因而AFLP分析產(chǎn)生的主要是由兩個(gè)酶共同酶切的片段。AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高的優(yōu)點(diǎn)。但它的技術(shù)費(fèi)用昂貴，對(duì)DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高。盡管AFLP技術(shù)誕生時(shí)間較短，但可稱(chēng)之為分子標(biāo)記技術(shù)的又一次重大突破，被認(rèn)為是目前一種十分理想、有效的分子標(biāo)記。?。?）　酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(Cleav

8、edAmplifiedPolymorphismSequences，CAPS)CAPS技術(shù)又稱(chēng)為PCR—RFLP，它實(shí)質(zhì)上是PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)結(jié)合的一種方法。CAPS的基本原理是利用己知位點(diǎn)的DNA序列資源設(shè)計(jì)出一套