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《蛋白復(fù)性(一)-綜述：包涵體表達(dá)的蛋白的復(fù)性》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、蛋白復(fù)性（一）-綜述：包涵體表達(dá)的蛋白的復(fù)性摘要:摘要綜述了包涵體形成、包涵體分離和溶解、包涵體折疊復(fù)性的方法、復(fù)性產(chǎn)率低下的主要因素以及通過(guò)分子伴侶、低分子量添加物等的應(yīng)用而提高了蛋白質(zhì)復(fù)性產(chǎn)率。關(guān)鍵詞包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性AbstractStrategiesfordecreasingtheformationofinclusionbodies,isolationandresolutionofinclusionbodies,refoldi......·專題推薦：·臨床快報(bào)·藥市動(dòng)態(tài)·違法廣告·醫(yī)保動(dòng)態(tài)·藥品
2、價(jià)格·流感疫情·保健常識(shí)·婦科課堂·醫(yī)改動(dòng)態(tài) 摘要綜述了包涵體形成、包涵體分離和溶解、包涵體折疊復(fù)性的方法、復(fù)性產(chǎn)率低下的主要因素以及通過(guò)分子伴侶、低分子量添加物等的應(yīng)用而提高了蛋白質(zhì)復(fù)性產(chǎn)率 關(guān)鍵詞包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性 AbstractStrategiesfordecreasingtheformationofinclusionbodies,isolationandresolutionofinclusionbodies,refoldingofinclusionbodyproteinsandtheca
3、useofdecreasedrefoldingyieldswereincluded.Renaturationyieldofrecombinantproteinhavebeenimprovedbyusingsomeadditives,suchasmolecularchaperone,smallmolecules. Keywordsinclusionbody,protein,renaturation 外源基因在腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成，雖然包涵體具有富集目標(biāo)蛋白質(zhì)、抗蛋白酶、對(duì)宿主毒性小等
4、優(yōu)點(diǎn)，但包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性率般都很低,而分子伴侶、低分子量添加物等在復(fù)性過(guò)程中的應(yīng)用及新的復(fù)性方法的建立都大大提高了重組蛋白質(zhì)復(fù)性產(chǎn)率。 一、包涵體： 1.1包涵體的定義、組成與特性： 包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無(wú)活性的固體顆粒。一般含有50%以上的重組蛋白，其余核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂糖等，大小為0.5-1um，具有很高的密度（約1.3mg/ml），無(wú)定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸
5、胍等。NMR等新技術(shù)的應(yīng)用表明包涵體具有一定量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，他們可能在復(fù)性的啟動(dòng)階段中具有一定的作用。[1] 1.2包涵體的形成： 主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過(guò)程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)率過(guò)高，超過(guò)了細(xì)菌正常的代謝水平，由于細(xì)菌的δ因子的蛋白水解能力達(dá)到飽和，使之表達(dá)產(chǎn)物積累起來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對(duì)
6、，過(guò)多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等?！ ?.2.2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說(shuō)含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)?！ ?.2.3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體?！ ?.2.4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀?！ ?.2.5、蛋白質(zhì)在合成之后，于中性pH或接近中性pH的環(huán)境下，其本身固有的溶解
7、度對(duì)于包涵體的形成比較關(guān)鍵，即是說(shuō)，有的表達(dá)產(chǎn)率很高，如Aspartase和Cyanase,表達(dá)產(chǎn)率達(dá)菌體蛋白的30%,也不形成包涵體，而以可溶形式出現(xiàn)。[2] 1.2.6、在細(xì)菌分泌的某階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成?！ ?.3包涵體破菌、分離、洗滌及溶解 1.3.1基因工程菌發(fā)酵液，經(jīng)離心濃縮后，可用：機(jī)械破碎、超聲破碎：?jiǎn)渭兂暺扑?，在小?guī)模下且菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞和局部產(chǎn)熱等原因，很難用于大體積細(xì)胞懸液的破碎，樣部分未破碎細(xì)胞與包涵
8、體混在一起，給后期純化帶來(lái)困難。因此，在較大規(guī)模純化時(shí)先用溶菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜，再結(jié)合超聲破碎方法，可顯著提高包涵體的純度和回收率。以及化學(xué)方法破碎使細(xì)菌裂解,然后以5000-20000g15min離心，可使大多包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離?！ ?.3.2洗滌：為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑,過(guò)高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)使包涵體溶解，如2M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中
